基于16S rRNA部分序列探討部分鳚亞目魚類的分子系統(tǒng)進化關(guān)系

張源真, 王 偉, 姜志強, 張 釗

(大連海洋大學(xué) 生命與水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點開放實驗室, 遼寧 大連 116023)

基于16S rRNA部分序列探討部分鳚亞目魚類的分子系統(tǒng)進化關(guān)系

張源真, 王 偉, 姜志強, 張 釗

(大連海洋大學(xué) 生命與水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部海水增養(yǎng)殖學(xué)重點開放實驗室, 遼寧 大連 116023)

通過PCR擴增獲得了3科5屬6種中國黃渤海海域的鳚亞目(Blennioidei)魚類的線粒體16S rRNA基因序列片段約669bp堿基, 結(jié)合來自GenBank的5種鳚亞目其他科魚類的相應(yīng)基因片段, 并以眼斑雪冰魚(Chionodraco rastrospinosus)為外群, 生成供系統(tǒng)發(fā)育分析的序列矩陣, 利用MEGA 4.0軟件分析序列的堿基組成、差異百分比、轉(zhuǎn)換／顛換值等, 應(yīng)用最大簡約法(MP)和鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示：在鳚亞目魚類的 16S rRNA片段生成的序列矩陣中發(fā)現(xiàn)有堿基的插入缺失現(xiàn)象, 共有207 bp變異位點, 轉(zhuǎn)換／顛換值為0.8, 堿基平均差異為3.36; 支持綿鳚(Enchelyopus elongates)歸于鳚亞目綿鳚科(Zoarcidae),鳚(Azuma emmnion)歸于鳚亞目線鳚科(Stichaeidae); 方氏云鳚(Enedrias fangi)和云鳚(Enedrias nebulosus)種間遺傳距離只有0.01, 親緣關(guān)系最近。

鳚亞目(Blennioidei); 線粒體DNA; 16S rRNA基因序列; 系統(tǒng)發(fā)育

鳚亞目(Blennioidei)魚類是鱸形目(Perciformes)中較大的一個亞目, 已有標(biāo)本和文獻資料顯示, 中國海區(qū)現(xiàn)有鳚亞目魚類8科33屬78種[1], 多為海洋魚類, 世界性分布。由于其大多體型較小, 所以以鳚亞目魚類為研究對象的報道相對較少。目前, 國內(nèi)外對鳚亞目魚類的研究較少, 大多局限于形態(tài)分類學(xué)方面[2-6], 對其分類區(qū)系、系統(tǒng)發(fā)生, 尤其是分子水平的系統(tǒng)發(fā)生研究更是鮮有報道。而魚類親緣關(guān)系等系統(tǒng)發(fā)生進化方面的研究是魚類生物學(xué)的一個重要組成部分, 針對鳚亞目魚類亞目與科之間及屬種之間的系統(tǒng)關(guān)系仍不明確的現(xiàn)狀[7-9], 研究鳚亞目魚類分子系統(tǒng)進化關(guān)系具有重要意義。

線粒體 DNA(mitochondrial DNA, 簡稱mtDNA)結(jié)構(gòu)簡單, 母性遺傳, 進化速度快且不發(fā)生重組, 是一種應(yīng)用較廣的分子標(biāo)記[10-13], 其中一些基因已經(jīng)被廣泛用于系統(tǒng)進化研究[14-17]。16S rRNA的結(jié)構(gòu)既具有保守性區(qū)域又具有高變性區(qū)域。保守性區(qū)域的變異能夠反映物種的親緣關(guān)系, 為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索; 高變性區(qū)域的變異能揭示出生物物種的特征核苷酸序列, 是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)[18]。因此基于其在分類分析中的應(yīng)用, 一般認(rèn)為16SrRNA適用于種以上水平的變異分析[19]。作者以線粒體16S rRNA基因作為分子標(biāo)記對鳚亞目的11種魚類的部分序列進行分析, 應(yīng)用NJ、MP 等法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 通過分析其基因序列變異及種群遺傳結(jié)構(gòu), 以便為鳚亞目物種的分類提供可參考的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為鳚亞目魚類, 采樣地點為以遼寧大連黑石礁附近海域為主的黃渤海海域(表1), 采集后在–20℃下保存待用。

研究直接測定了黃渤海鳚亞目魚類共計 3科 5屬 6種, 并結(jié)合 GenBank下載其他 5種鳚亞目 16S rRNA序列的相應(yīng)片段, 共計7科10屬11種鳚亞目魚類進行分析, 并以鱸形目南極魚亞目(Notothenioidei)鱷冰魚科(Channichthyidae)的眼斑雪冰魚(Chionodraco rastrospinosus)作為外類群, 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(表2)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取約0.05 g肌肉放入1.5 mL的離心管中, 加400 μL DNA裂解液, 加入 20 μL的10%的 SDS, 剪碎,再加3 μL蛋白酶K, 于55℃加熱2 h, 每隔15 min輕搖一次, 加入 100 μL乙酸鉀混勻, 靜置 30 min,冷凍離心10 min(12 000 r/min, 4 ℃), 將上清液吸入另一個管中, 加1 mL 100%冰乙醇, 4 ℃或者–20 ℃放1 h, 冷凍離心, 將沉淀用4 ℃下 70 %冰乙醇洗滌2次(一次加200 μL), 室溫干燥30 min, 加TE或雙蒸水(dd H2O)50 mL溶解, 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 鳚亞目魚類采樣地及采樣和測序數(shù)量Tab. 1 Locality and numbers of Blennioidei

表2 實驗所選用的鳚亞目魚類16SrRNA基因信息Tab. 2 Information for 16SrRNA genes of Blennoidei

1.2.2 線粒體16SrRNA基因片段擴增

用于PCR擴增的引物為自行設(shè)計的16SAR(5’-TTAGTTTGGTGTCCCGAA-3’)和 16SBR(5’-GCAAGAGGCGATGTTTTT-3’), 由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL, 包括 2.0 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 0.2 μmol/L每種引物,1 UTaqDNA聚合酶(TAKARA), 1×Taq聚合酶緩沖液以及50 ng基因組DNA。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s, 56℃退火45 s,72℃延伸1 min, 共計35個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化, 送至上海生工生物工程公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用 DNAstar 和 ClustalX1.8 軟件分析已比對驗證過的鳚亞目16SrRNA基因序列[20], 用MEGA 4.0中的 P-Distance模型計算種內(nèi)和種間遺傳距離[21],采用鄰接法 (neighbour-joining, NJ)、最大簡約法(maximum parsimony, MP) 構(gòu)建進化系統(tǒng)樹, 系統(tǒng)樹各分支的置信度采用重抽樣法( bootstrap) , 通過1 000次循環(huán)評估系統(tǒng)樹的可靠性。用DNA sp 5.10統(tǒng)計單倍型[22]。

2 結(jié)果

2.1 鳚亞目魚類16SrRNA基因堿基組成

研究所用引物位于 16S基因 5′端, 擴增片段長度范圍為651～674 bp, 平均669 bp。將實驗獲得序列連同 GenBank下載序列一并比對, 比對后序列同源長度為578bp(含插入缺失位點)。分析結(jié)果表明, 38個個體共存在 31個單倍型, 單倍型變異指數(shù)為0.0000～1.0000(平均0.6259), 核苷酸多樣性為0.0000～0.04349(平均 0.0091); 11個物種中 45.45%的物種存在堿基插入和缺失現(xiàn)象, 共存在27個插入缺失位點, 其中, 方氏云鳚插入缺失現(xiàn)象最嚴(yán)重, 插入缺失位點數(shù)為12個; 多態(tài)性位點共計113個, 平均每個物種的多態(tài)性位點數(shù)為 10個, 其中鳚的多態(tài)性位點數(shù)最多(52)(表3)。38條鳚亞目魚類 16S rRNA 序列的平均堿基組成分別為 T：23.10%、C：24.80%、A：30.50%、G：21.70%, 其中, A+T 含量(53.60%)明顯高于 G+C含量(46.40%), 堿基組成表現(xiàn)出明顯的偏倚性。3個密碼子GC含量差異較大(表4), 其中第2密碼子GC平均含量最高, 達(dá)51.50%; 第3位密碼子次之, 平均為45.70%, 第1密碼子最小, 平均僅為42.20%。表5列出了16S rRNA序列的核苷酸變異情況。在578個位點中, 不變位點有371個, 第1、2、3密碼子的不變位點相當(dāng), 分別為120、127和123個; 第3密碼子位點上的轉(zhuǎn)換頻率最高, 為15.88%; 第1密碼子位點上的顛換頻率最高, 為18.44%。

表3 11種鳚亞目魚類16SrRNA基因序列特征Tab. 3 Characteristics of 16SrRNA sequences from 11 species of Blennoidei

表4 11種鳚亞目魚類16SrRNA基因部分序列堿基平均分布概率(%)Tab. 4 Average nucleotide frequencies of 16SrRNA partial sequences of 11 Blennoidei (%)

表5 11種鳚亞目魚類38個個體的16SrRNA部分序列密碼子變異情況Tab. 5 Sequence variation of 16SrRNA gene of 11 Blennoidei species

2.2 種內(nèi)及種間遺傳距離

應(yīng)用MEGA 4.0中P-Distance模型計算38條鳚亞目魚類 16S rRNA基因序列的種內(nèi)和種間的遺傳距離(表6)。11個物種的種內(nèi)平均遺傳距離為0.0064,81.82%的種內(nèi)遺傳距離為0.0000。其中,鳚種內(nèi)遺傳距離最大(0.05)。11個物種的種間平均遺傳距離為0.7236, 是種內(nèi)遺傳距離的113.06倍。其中, 同屬于錦鳚科的方氏云鳚與云鳚之間的種間遺傳距離最小(0.010)。

表6 11種鳚亞目魚類的種間及種內(nèi)遺傳距離Tab. 6 Genetic distance within-species and between 11 Blennoidei species

2.3 鳚亞目魚類分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

基于鳚亞目魚類的16S rRNA部分序列片段, 以眼斑雪冰魚為外類群對鳚亞目進行系統(tǒng)發(fā)育分析。應(yīng)用 MP和鄰接分析法(NJ)法構(gòu)建了分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹(圖1)。用 1000次 Bootstrap(BP)表示統(tǒng)計分析后對該支的支持百分?jǐn)?shù), 其數(shù)值標(biāo)于樹分支的上面。采用MP法將鳚亞目魚類分成兩個類群, 其中方氏云鳚、云鳚、鳚、雞冠鳚、綿鳚和與 Genebank下載的云鳚(FJ687233Enedrias nebulosus)聚為一群(I),花體草鳚、毛鳚、六線鳚、三鰭鳚、鮑喬無眉鳚和黃喉煙管鳚聚為另一群(II)。第一類群中綿鳚位于進化樹的基部, 其他4種魚分為兩支, 其中方氏云鳚、云鳚和Genebank下載的云鳚聚在一起,鳚和雞冠鳚聚在一起。另一類群中花體草鳚位于系統(tǒng)樹的基部, 而毛鳚和黃喉煙管鳚聚在一起為一獨立分支,鮑喬無眉鳚、六線鳚和三鰭鳚為另一分支, 其中六線鳚與三鰭鳚又聚在一起。鄰接分析法所得系統(tǒng)樹與MP樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)略有差異(圖1) 。NJ 樹同樣以極高的置信度值(100%) 將鳚亞目魚類分成兩個類群,不同的是第一分支明顯分為兩支, 云鳚和方氏云鳚聚在一起分支, 綿鳚、雞冠鳚和鳚聚在一起。黃喉煙管鳚位于第二分支的基部。

圖1 MP法(a)、NJ 法(b)構(gòu)建鳚亞目魚類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 MP (a) and NJ (b) tree based on the analysis of 16SrRNA genes from 11 Blennoidei species

3 討論

3.1 鳚亞目魚類線粒體16SrRNA基因結(jié)構(gòu)特征

本研究擴增了6種鳚亞目魚類的16S rRNA 基因片段序列,其中六線鳚,方氏云鳚和云鳚在GenBank中已有記錄, 與其對應(yīng)物種進行相似性檢驗發(fā)現(xiàn), 二者相似性均在 95% 以上, 說明同源性較高, 適合做下一步的分析?；?6S rRNA序列計算得到的轉(zhuǎn)換顛換比(Si/Sv)小于 2.0, Knight[23]認(rèn)為該比例小于2.0則說明突變已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài), 受進化噪音影響的可能性較大, 在生物的進化過程中, 轉(zhuǎn)換較顛換更易發(fā)生, 因此本研究得到的數(shù)據(jù)間接說明了鳚亞目魚類之間維持著一定的遺傳變異水平。本研究得到的鳚亞目魚類 16S rRNA 基因片段存在AT偏倚現(xiàn)象, 在堿基組成中, A+T含量明顯高于G+C, 這一結(jié)果與其他研究者在無脊椎動物和魚類等得到的結(jié)果相吻合[24-26]。此外,本研究得到的鳚亞目魚類16S rRNA基因存在堿基插入缺失現(xiàn)象, 這種現(xiàn)象在脊椎動物中較為常見, 鄭文娟[27]等認(rèn)為科魚類16SrRNA基因存在著堿基插入缺失現(xiàn)象。

3.2 鳚亞目魚類分類關(guān)系的探討

從表3～表6可見, 利用16S rRNA基因序列對中國黃渤海海域的 6種鳚亞目魚類的堿基差異進行比較,發(fā)現(xiàn)方氏云鳚與云鳚的堿基差異非常小, 種間遺傳距離僅為 0.01, 這說明方氏云鳚和云鳚親緣關(guān)系很近,而六線鳚與其他 5種魚的堿基差異比較大,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。由圖1可見, 中國黃渤海海域的5種魚類在分類地位上較Genebank下載的關(guān)系較遠(yuǎn)。但是從圖1可以看出, 六線鳚與Genebank中的三鰭鳚聚為一支, 推測它們可能具有較近的親緣關(guān)系。從進化樹的結(jié)果來看, 與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果大致一致。李明德[7-8]等以鳚亞目魚類為研究對象, 根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將鳚亞目魚類共分為兩個亞目, 其中將錦鳚科、綿鳚科和線鳚科歸為綿鳚亞目,三鰭鳚科、鳚 科和磯鳚科歸為鳚亞目, 將鳚歸為錦鳚科; 劉靜[1]等從鳚亞目地理分布角度進行研究, 得到與李明德不一致的結(jié)論,其將錦鳚科、綿鳚科和線鳚科歸為鳚亞目,將鳚歸為線鳚科; 劉禪馨[9]等對鳚亞目魚類的形態(tài)學(xué)研究與劉靜的研究結(jié)果具有相似之處, 其將錦鳚科和線鳚科歸為鳚亞目,綿鳚科歸為綿鳚亞目,將鳚歸為線鳚科,綿鳚歸為綿鳚科。而本研究中,線鳚科的六線鳚與鳚科、磯鳚科及三鰭鳚科的魚聚為一支,鳚和雞冠鳚聚在一起, 支持劉靜[1]和劉禪馨[9]的分類結(jié)果; 綿鳚與鳚、雞冠鳚聚為一支, 支持劉靜[1]等將綿鳚劃歸至鳚亞目的結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示方氏云鳚、云鳚、六線鳚和三鰭鳚處于系統(tǒng)進化樹的頂端, 代表著最新演化的種類。此外, 從形態(tài)學(xué)上六線鳚與雞冠鳚同屬線鳚科, 而系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果顯示雞冠鳚與鳚聚在一起, 可以認(rèn)為可能屬于同一科,六線鳚與三鰭鳚聚在一起, 可能屬于同一科, 這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果有一定出入。有分子系統(tǒng)學(xué)家認(rèn)為, 當(dāng)所分析的序列長度一定時, 盡量選擇較多的分類群有助于獲得更準(zhǔn)確的結(jié)論[28-29],由于本研究的物種類別及數(shù)量有限, 因此關(guān)于六線鳚和雞冠鳚的分類地位和親緣關(guān)系等還有待于進一步研究論證。在研究鳚亞目時對比 MP、NJ兩種不同的系統(tǒng)發(fā)育方法發(fā)現(xiàn), MP樹中綿鳚和黃喉煙管鳚所處的位置與在NJ樹中的不一致, 推測原因可能是以NJ法為代表的距離法可以使種間的進化距離在度量樹中得到直觀的體現(xiàn), 但由于無法避免將性狀數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為距離時的信息丟失; 而最大簡約法(MP) 可以解決空位問題, 對進化過程假設(shè)較少, 但其基于最小進化原則的合理性仍存在爭議[30]。

3.3 方氏云鳚和云鳚的分類地位

方氏云鳚和云鳚同屬于鳚亞目, 錦鳚科, 云鳚屬。云鳚屬主要形態(tài)特征是體側(cè)扁而延長, 似帶狀,被鱗; 口小, 斜裂。上下頜及犁骨齒細(xì)小; 顎骨無齒;鰓蓋膜寬而相連, 與峽部分離, 被圓鱗, 細(xì)小, 無側(cè)線。背鰭低而延長, 均由鰭棘組成, 始于頭后;臀鰭亦延長, 前方有二鰭棘, 胸鰭短圓, 腹鰭短小,喉位, 具一鰭棘及一鰭條, 尾鰭短圓, 無后匙骨; 軀干部脊椎骨橫突合成脈弧,無幽門盲囊[31]。在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類中,云鳚與方氏云鳚這2個種的主要特征很接近, 唯有頭長與胸鰭長的比例有些差別(頭長為胸鰭長的兩倍以上者為云鳚, 1.5倍左右者為方氏云鳚), 所以一般在形態(tài)上很難準(zhǔn)確區(qū)分兩者。為了更好地探討云鳚和方氏云鳚的親緣關(guān)系, 構(gòu)建了16SrRNA的系統(tǒng)進化樹。從分子水平看,本研究得到的方氏云鳚和云鳚的種間遺傳距離最小(僅為0.01), NJ和MP樹中顯示,方氏云鳚和云鳚二者聚在一起, 表示兩者親緣關(guān)系較近。有些學(xué)者則認(rèn)為在進行物種系統(tǒng)進化研究時, 由于一些變異不能及時積累, 導(dǎo)致較保守的基因不適用于分析一些進化年齡較短、分化速度快的物種間的親緣關(guān)系[32-33], 而且單個基因能提供的信息往往較為有限[34]。因此說明16S rRNA基因可能更適合科水平及以上分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究, 不適于種水平間的研究。若要更好地闡明鳚亞目魚類系統(tǒng)進化問題, 還需更大范圍地采集更多種類及更大數(shù)量的樣本進行進一步驗證; 同時應(yīng)采用進化速率不同的多個基因(包括線粒體和細(xì)胞核基因)對鳚亞目進行研究, 以保證結(jié)論的可靠性?；诖? 鳚亞目魚類系統(tǒng)進化關(guān)系仍需進一步深入研究。

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Molecular phylogenetic relationship of blennioidei based on partial sequence of mitochondrial 16S ribosomal RNA gene

ZHANG Yuan-zhen, WANG Wei, JIANG Zhi-qiang, ZHANG Zhao
(Key Laboratory of Marine Aquaculture, College of Fisheries and Life Science, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, Liaoning)

Sep., 01, 2011

Blennioidei; mitochondrial DNA (mtDNA); 16S ribosomal RNA (16S rRNA);molecular phylogeny

The 16S ribosomal RNA partial sequences of 6 species within 5 genera from Blennioidei in China yellow and bohai seas were amplified using PCR technique. Approximately, 669 bp gene fragments were obtained. These data were combined with other homologous sequences of 5 species from Blennioidei, which were downloaded from the GenBank.Chionodraco rastrospinosuswere designed as outgroup. Nucleotide composition frequencies,P-Distance genetic distance and transition/transversion ratios were analyzed with MEGA 4.0 software. Molecular phylogenetic trees were constructed by the maximum parsimony (MP) and neighborjoining (NJ) methods. There were insertions and deletions in the aligned base pairs. Two hundred and seven bp variable sites were found in the analysis matrix. The average ts/tv ratio and average percentage divergence among all pairwise comparisons were 0.8 and 3.36, respectively. According to the partial sequence of mitochondrial 16S ribosomal RNA gene, the classification system of Blennioidei was acceptable, which is classified as Pholidae, Zoarcidae, Stichaeidae, Clinidae,Blenniidae, Chaenopsidae and Tripterygiidae.Enedrias fangiandEnedrias nebulosushad a close relationship, as the genetic distance between the two species of partial 16S ribosomal RNA gene was only 0.01.

Q959 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-3096(2012)09-0089-07

2011-09-01;

2011-12-06

遼寧省重大科技公關(guān)項目(2008203002);遼寧省教育廳計劃項目(2009A175)

張源真(1986–), 女, 內(nèi)蒙古呼和浩特人, 碩士研究生, 主要從事魚類群體遺傳學(xué)研究, E–mail：lipc@sohu.com; 王偉, 通信作者,E–mail：wangwei@dlou.edu.cn

譚雪靜)