羧基化磁性納米微球的表面生物修飾方法

石 良， 王錫昌， 劉 源， 盧 瑛

（上海海洋大學 食品學院，上海 201306）

羧基化磁性納米微球的表面生物修飾方法

石 良， 王錫昌， 劉 源， 盧 瑛＊

（上海海洋大學 食品學院，上海 201306）

采用A和B兩種羧基化磁珠，以山羊抗小鼠IgG為模式蛋白，優(yōu)化了EDC／sulfo－NHS法的羧基磁珠表面抗體的修飾條件，對比分析了抗體修飾前后磁珠粒徑和多分散系數(shù)（PDI）的變化，并利用競爭性免疫層析法評價了磁珠表面修飾抗體的生物學活性。優(yōu)化結果顯示，不同粒徑和廠家的羧基磁珠，其表面的最佳抗體修飾條件是不同的。磁珠A抗體修飾前后的平均水力學粒徑變化率為6.55%，PDI分別為0.011和0.046，變化微小，而磁珠B在抗體修飾前后的平均水力學粒徑變化率為135.55%，分散性能變差。生物學活性評價結果顯示優(yōu)化條件下制備的磁珠A和B表面的抗體均具有較好的抗原結合活性，磁珠B的磁信號強于磁珠A。綜上所述，抗體修飾磁珠用于免疫層析檢測時，抗體修飾前后磁珠粒徑和分散性能的變化、材料的磁響應性能對于檢測靈敏度和層析速度具有重要意義。

磁珠；生物修飾 ；EDC；免疫層析

超順磁性納米微球（Superparamagnetic nanoparticles，SMNs，簡稱磁珠）的主要特點是在外加磁場的作用下可以被磁化而顯示出磁性，能夠被迅速分離出來。當外加磁場撤離后它沒有剩磁因而又可重新分散到液體中，其生物相溶性和懸浮穩(wěn)定性較好［1－2］。生物活性分子可通過磁珠表面的官能基團結合到SMNs上，應用于分離、檢測和臨床診斷等領域中［1，3－6］，是醫(yī)學、分子生物學、免疫學等研究中的重要載體工具。另外，研究顯示SMNs結合免疫層析技術和磁性分析系統(tǒng)可以實現(xiàn)定量的快速檢測，目前在人促絨毛性腺激素、心肌肌鈣蛋白及HIV病毒等的快速檢測中已有相應報道［7－9］。

根據(jù)表面化學基團的不同，磁珠可采用不同的化學交聯(lián)劑，如醛類（甲醛、戊二醛等）、碳化二亞胺類、雙環(huán)氧類物質以及氰異酸鹽等［10］進行生物分子的修飾。羧基化磁珠表面生物分子的修飾以碳二亞胺類中的1－乙基－（3－二甲基氨基丙基（EDC）縮合法最為常用。Gélinas等［11］成功地將 Diethylenetriamine（DETA）配體固定到羧基化磁珠的表面，并發(fā)現(xiàn)蛋白質在功能化磁珠表面的偶聯(lián)率、生物學活性及磁珠粒徑的變化均會直接影響到其應用效果［11－12］。作 者 以 山 羊 抗 小 鼠 （Goat anti－mouse，GAM）IgG為模式蛋白，以EDC與磺酸基琥珀酰亞胺 （sulfo－NHS）為交聯(lián)劑，對羧基化磁珠表面抗體的修飾條件進行了優(yōu)化。此外，通過比較不同種類磁珠在修飾甲殼類主要過敏原原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm）特異性抗體后的生物學活性，探討了適用于免疫層析檢測的羧基化磁珠的表面生物修飾方法。

1 材料與方法

1.1 材料

刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）：購自上海泥城集貿市場。EDC、sulfo－NHS：上海延長生化公司產品；BSA：上海生工產品、無水嗎啉乙磺酸：MES，Shanghai Mdmy Science＆Technology公司產品；山羊抗鼠IgG：杭州隆基生物公司產品；其它均為國產分析純試劑；原肌球蛋白及抗原肌球蛋白單抗為實驗室自行制備純化；Protein G親和層析柱：GE公司產品；羧基化磁珠A、樣品墊、結合墊、硝化纖維膜、吸水紙、PVC底板：美國Magna Biosciences公司產品；羧基化磁珠B：上海奧潤微納公司產品。

磁信號檢測儀（Magnetic assay reader，MAR）：美國Magna Biosciences公司產品；HPPS5001高性能納米粒度分析儀：英國Malvern公司產品。

1.2 方法

1.2.1 原肌球蛋白及其特異性單克隆抗體的分離純化蝦類主要過敏原Tm的純化參照蔡秋鳳等［13］的方法并稍作修改?？筎m的單抗［14］為實驗室前期研究成果，采用Protein G親和層析柱，按照產品所附操作說明進行純化。

1.2.2 磁珠的表面生物修飾羧基化磁珠的表面GAM Ig G生物修飾采用EDC和NHS的化學交聯(lián)方法，其反應原理如圖1所示。EDC與磁珠表面的羧基反應，形成氨基反應活性的O－?；逯虚g體，抗體的伯胺可與磁珠的該中間體反應而修飾磁珠（途徑1）；另外該中間體在水溶液中不穩(wěn)定，易于水解，可重新生成羧基磁珠（途徑2），可通過加入sulfo－NHS可以將該中間體轉化為氨基反應活性的NHS酯，加快與伯胺結合（途徑3）。具體操作流程如下：（1）活化反應：取1 mg羧基磁珠于2 m L離心管中，用250μL 5 mmol／L MES 溶液含0.05 g／d LTween－20（簡稱MEST）作為活化緩沖溶液洗滌2次后，加入EDC與sulfo－NHS，其最終反應體積為250μL，混合均勻后室溫旋轉反應30 min。（2）偶聯(lián)反應：以1 mmol／L的硼酸鹽溶液含0.05 g／d L Tween－20（簡稱BST）作為偶聯(lián)緩沖液，先用BST溶液洗滌磁珠2次，然后用適量BST溶液重懸磁珠，加入100μg GAM IgG抗體，最終反應體積為250μL，室溫旋轉反應4 h后回收反應上清用于蛋白定量。（3）封閉處理：偶聯(lián)結束后加入250μL含有1 g／d L BSA的BST溶液（簡稱BST－BSA）室溫反應30 min，以封閉殘留的活化基團。最后用250 μL含0.02 g／d L Na3N 的 BST－BSA 重懸磁珠，4℃冷藏備用。

圖1 羧基磁珠的EDC／sulfo－NHS法表面抗體修飾原理圖Fig.1 Scheme of antibody modification on the surface of SMNs by EDC and sulfo－NHS method

1.2.3 磁性納米微球表面抗體修飾的條件優(yōu)化為探討最佳的抗體修飾條件，作者分別對不同p H值 （3.0～7.0）的 MEST活化緩沖液，不同活化反應時間（10～50 min），不同交聯(lián)劑EDC的質量分數(shù)（0.125～2%），不同EDC／sulfo－NHS質量比（4∶1～1∶4），不同p H 值（7.0～9.5）的BST偶聯(lián)緩沖液，不同偶聯(lián)反應時間（1～6 h）及不同抗體加入量（25～150μg）均做了3次平行優(yōu)化實驗，并通過檢測抗體修飾后羧基表面的抗體量即偶聯(lián)量進行修飾效果的評價，具體實驗操作同1.2.2所述。

1.2.4 磁珠粒徑分布檢測生物修飾前后羧基磁珠的水力學粒徑分布狀況和描述聚合物試樣相對摩爾質量多分散程度的多分散系數(shù)（Polydispersity index，PDI）采用HPPS5001型高性能納米粒度分析儀進行檢測，它基于懸浮液中顆粒的無規(guī)則運動（布朗運動）和對激光束的光散射原理，水力學尺寸是包括顆粒表面水化層在內的粒徑分布，其中PDI值 越小，顆粒分散性越好。測量條件為：λ＝632.8 nm，T＝25℃。

1.2.5 抗體偶聯(lián)量的測定羧基磁珠表面抗體修飾后的蛋白質含量以偶聯(lián)反應后的回收上清液為樣本，采用經典的Bradford法［15］檢測蛋白質含量?？贵w偶聯(lián)量按下述公式進行計算：

1.2.6 抗體修飾磁珠的生物學活性評價為評價磁珠表面所修飾抗體的生物學活性，利用優(yōu)化后的反應條件制備過敏原Tm的特異性單抗修飾磁珠，并以此作為標記載體構建了競爭性免疫層析試紙條。實驗所用的免疫層析試紙條由PVC底板、樣品墊、結合墊、硝化纖維膜和吸水紙構建而成；分別以PBS溶液（A1和 B1）、含0.05 mg／m L BSA 的PBS溶液（A2和B2）、含0.05 mg／m L過敏原 Tm的PBS溶液（A3～A4、B3～B4）（圖5）噴點在硝化纖維膜上作為檢測線T線，2 mg／m L羊抗鼠IgG噴點在硝化纖維膜形成控制線C線對磁珠表面修飾的抗體活性進行了評價。T線和C線的噴點量均為1.0μL／cm。檢測時先取5μL單抗修飾磁珠（2 mg／m L）點于試紙條的結合墊處，然后在樣品墊處加入100μL PBS溶液或者含純化后的過敏原Tm的PBS待測溶液，室溫層析20 min后用MAR儀定量檢測C線和T線的磁信號。

2 結果與分析

2.1 活化反應條件對抗體偶聯(lián)量的影響

不同活化反應條件對羧基磁珠A和B表面抗體偶聯(lián)量的影響如圖2所示。由圖2（a）可知，磁珠A和B表面的抗體偶聯(lián)量隨p H值的升高均呈現(xiàn)下降趨勢；在相同p H值時，磁珠A的抗體偶聯(lián)量高于磁珠B，說明磁珠A的抗體修飾效果好于磁珠B。隨著活化反應時間的增加，磁珠A和B表面的偶聯(lián)量均顯示出先顯著增加后逐漸下降趨勢，但是在相同的活化時間，磁珠A表面抗體偶聯(lián)量高于磁珠B，且兩種磁珠表面的最高抗體偶聯(lián)量所需要的活化反應時間也是不同的。磁珠A在活化反應20 min時其抗體偶聯(lián)量最高，而磁珠B則在活化反應30 min時抗體偶聯(lián)量最高（圖2b）。相同偶聯(lián)條件下，磁珠A表面抗體偶聯(lián)量大于磁珠B，這是因為磁珠表面羧基含量與抗體偶聯(lián)量直接相關。磁珠A表面羧基含量為350μmol／g大于磁珠B的200 μmol／g。由圖1反應原理圖可知羧基含量高使較多的活性集團能與抗體伯胺進行交聯(lián)。

在低p H時交聯(lián)劑EDC與羧酸形成的中間體不穩(wěn)定，容易分解［16］，但p H值過高時，部分不穩(wěn)定中間物水解可能會釋放出EDC或者使半穩(wěn)定的氨基反應活性中間物的產量減少從而造成蛋白質與中間物的取代反應速度下降，使蛋白質偶聯(lián)量下降［17］。因此在后續(xù)優(yōu)化實驗中，磁珠A的活化反應條件為：p H 5.0 MEST活化反應20 min；磁珠B的活化反應條件為：p H 5.0 MEST活化反應30 min。

圖2 活化緩沖液pH（a）和活化時間（b）對抗體偶聯(lián)量的影響Fig.2 Effect of activation solution pH （a），activation time（b）on antibody coupling amount

2.2 交聯(lián)劑對抗體偶聯(lián)量的影響

交聯(lián)劑對磁珠表面抗體偶聯(lián)量的影響實驗結果如圖3所示。由圖3（a）可知，不論是磁珠A還是磁珠B，當交聯(lián)劑EDC質量濃度小于0.5 g／d L時，抗體偶聯(lián)量呈現(xiàn)上升趨勢，在0.5 g／d L時達到最高值，其后隨著EDC質量濃度的增加抗體偶聯(lián)量呈現(xiàn)下降趨勢。對于相同質量濃度的EDC，磁珠A的抗體偶聯(lián)量高于磁珠B。對于EDC和NHS的不同質量比，磁珠A和B均呈現(xiàn)出隨著質量比的增加其抗體偶聯(lián)量也增加，并在1∶1后呈現(xiàn)飽和趨勢（圖3b）。根據(jù)上述結果，在后續(xù)優(yōu)化實驗中EDC濃度選擇為0.5 g／d L，交聯(lián)劑 EDC和sulfo－NHS質量比則為1∶1。

圖3 EDC質量濃度（a）和EDC／sulfo－NHS質量比（b）對抗體偶聯(lián)量的影響Fig.3 Effect of EDC concentration（a），EDC and sulfo－NHS mass ratio（b）on antibody coupling amount

2.3 偶聯(lián)反應條件對抗體偶聯(lián)量的影響

偶聯(lián)反應條件對磁珠表面抗體偶聯(lián)量的影響結果如圖4所示。由圖可見，磁珠A和B的表面抗體偶聯(lián)量均隨著偶聯(lián)緩沖液p H值的增加而增加，達到最大值后又降低，磁珠A和磁珠B分別在p H8.5和p H9.0時達最大抗體偶聯(lián)量。另外，磁珠A和磁珠B隨著抗體加入量和偶聯(lián)反應時間的增加而增加，并逐漸趨向飽和。磁珠A在抗體加入125μg、偶聯(lián)反應4 h時其抗體偶聯(lián)量最高，而磁珠B則在100μg抗體、偶聯(lián)反應5h時出現(xiàn)最高偶聯(lián)量。在任一偶聯(lián)反應點，磁珠A的抗體偶聯(lián)量均高于磁珠B。根據(jù)上述結果，后續(xù)的優(yōu)化實驗中磁珠A和B的偶聯(lián)緩沖液p H值分別選擇8.5和9.0，磁珠A的最適偶聯(lián)反應時間選擇了4 h，而磁珠B則為5 h。考慮到單抗較難制備且價格較貴，因此作者認為抗體加入量在75～100μg范圍內進行選擇較為經濟，磁珠A和磁珠B在這個范圍的表面抗體密度為（33.05±1.11）～（44.36±1.35）μg。

圖4 偶聯(lián)緩沖液p H（a），偶聯(lián)時間（b）對抗體偶聯(lián)量的影響Fig.4 Effect of coupling buffer pH （a），coupling time（b）on antibody coupling amount

2.4 抗體修飾磁珠的粒徑分布檢測

磁珠經抗體修飾后的粒徑變化用納米粒度分析儀進行檢測，其結果如表1所示。由表可知，磁珠A在抗體修飾前后的平均水力學粒徑分別為248.6和264.9 nm，其粒徑變化率為6.55%，PDI分別為0.011和0.046，變化微小，說明磁珠的單分散性能較好；磁珠B在抗體修飾前后的平均水力學粒徑分別為104.9和247.1 nm，其粒徑變化率為135.55%，PDI由0.170變?yōu)?.451，說明磁珠B表面修飾抗體后，其單分散性能變差了。IgG型抗體在溶液中的最大長度為24 nm［18］，封閉液中的BSA尺寸較小，為9.5 nm［19］，以物理吸附方式結合在磁珠表面；因此抗體的修飾對磁珠的粒徑變化會有些許作用，但是磁珠B在修飾抗體后其粒徑出現(xiàn)了顯著性增加，其原因很可能是生物分子的修飾過程使磁珠粒子間的團聚從而造成其水力學尺寸的變化，XU等［20］報道了磁珠洗滌重懸的過程可能使其粒徑和多分散系數(shù)變大。

表1 修飾抗體前后磁珠的特征Tab.1 Characteristics of SMN－A and B before and after antibody modification

2.5 抗體修飾磁珠的生物學活性評價

Tm特異性單抗修飾磁珠的生物性活性評價結果見圖5（定性）和表2（定量）。由圖5可見，A1～A2和B1～B2試紙條在檢測線（T線）處無條帶，其T線的磁信號也非常弱（表2），與定性結果相一致，說明抗體修飾磁珠在T線未被捕獲；A3和B3試紙條在T線處有明顯的條帶，而A4和B4試紙條則顯示出微弱條帶，由表2可知A3和B3在T線處的磁信號為3 381.2和8 039.5 MAR，A4和B4分別為217.8和431.8 MAR，定量檢測結果與肉眼觀察的定性結果相吻合。

作者對單抗修飾磁珠的生物學評價采用的是競爭性抗原抗體反應原理，即T線上不噴點抗原時，試紙條上的抗體修飾磁珠因為沒有抗原抗體的結合反應而不能停留在T線上，若T線上噴點有抗原時，T線處就會有抗體修飾磁珠因特異性反應而被捕獲從而停留在此處，此時T線就會顯示出磁珠所帶的顏色，停留量與顏色強弱成正比。A1和B1檢測線處噴點的是PBS溶液，T線無條帶而C線有條帶說明試紙條體系是有效的；A2和B2檢測T線處噴點有含0.05 mg／m L BSA的PBS溶液，檢測后T線未出現(xiàn)條帶說明抗體修飾磁珠A和B均無假陽性反應。A3～A4、B3～B4試紙條在T線噴點的是過敏原Tm溶液，因A3和B3樣本是PBS溶液無競爭性反應，而A4和B4樣本中含有過敏原Tm，有競爭性反應因而T線條帶的顏色弱于A3和B3，上述樣本的定量檢測結果與肉眼觀察結果相一致，說明優(yōu)化后的修飾方法制備所得抗體修飾磁珠A和B均具有較好的抗原結合活性，可應用于后續(xù)的免疫學檢測中。

表2 抗體修飾磁珠A和B的磁信號比較Tab.2 Comparison of magnetic signal between antibody modifying SMN－A and B

圖5 抗體修飾磁珠A（a）和B（b）免疫層析效果比較Fig.5 Comparison of LFIA between antibody modifying SMN－A（a）and B（b）

3 結語

作者以GAM IgG為模式蛋白對羧基化磁珠的表面生物修飾方法進行了研究，修飾反應的優(yōu)化實驗結果顯示不同來源的磁珠，其表面的最佳抗體偶聯(lián)條件是不同的；此外，發(fā)現(xiàn)在相同的條件下，磁珠A表面抗體偶聯(lián)量均大于B。分析其原因，除于磁珠表面的羧基含量直接相關外，還可能與磁珠的單分散性能相關，磁珠的團聚會使其表面暴露的活性集團減少從而造成生物分子偶聯(lián)量的降低。免疫層析檢測結果表明這兩種磁珠在生物修飾后其表面的抗體均具有較好的抗原結合活性。但是B3的T線磁信號（8 039.5 MAR）大大高于 A3（3 381.2 MAR），而C線磁性號大大低于磁珠A3。其原因很可能是因為磁珠B經抗體修飾后其多分散性能下降，磁珠間發(fā)生了一定的團聚，從而對層析造成了物理屏障而使磁珠被截留引起的。雖然磁珠B的分散性較磁珠A差，但是其磁響應性強（B3和A3），這有助于提高定量檢測靈敏度。但是在實際應用時往往以C線的強弱來判斷試紙條的有效性，因此C線信號過弱易造成結果誤判。

綜上所述，對于不同廠家的同類型磁珠，即便是修飾同一生物分子，其生物分子所需的最佳修飾條件是不同的，會受到粒徑、官能基團含量等因素的影響。因此在應用此類磁珠進行免疫層析檢測時，尚需要考慮材料的磁性成分含量、多分散性能等因素，研究結果顯示抗體修飾前后磁珠粒徑和分散性能的變化、材料的磁相應性能對于檢測靈敏度和層析速度具有重要意義。

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Surface Biological Modification Research on Carboxylated Magnetic Nanoparticles

SHILiang，WANGXi－chang，LIUYuan，LUYing＊

（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Using goat anti－mouse IgG monoclonal antibody as model protein，antibody modification conditions on the surface of carboxylated superparamagnetic nanoparticles（SMN）A and B were optimized，then hydrodynamic sizes and polydispersity index（PDI）of SMN－A and B before and after antibody modification were compared.Additionally，the biological activity of modifying antibodies was assessed by a competitive format lateral flow immunoassay（LFIA）.Optimization results indicated that the best modification conditions were different for SMNs of different sizes and manufactures.Before and after modification，the hydrodynamic size change rate of SMN－A was 6.55%，PDI were 0.011 and 0.046，respectively，the change was minor，while hydrodynamic size change rate of SMN－B was 135.5%，and the dispersivity became worse.Furthermore，the antibody modifying on SMN－A and B both showed good biological activities by LFIA test，and SMN－A indicated better lateral flow performance.Briefly，if antibody modifying SMNs were chosen as labels in LFIA test，size and dispersivity change before and after modification，magnetic signal intensity of the material had great mean in improving detection sensitivity and assay rate.

magnetic nanoparticles，biological modification，EDC，lateral flow immunoassay

Q 819

A

1673－1689（2012）01－071－07

2011－03－31

“十一五”國家科技支撐計劃項目（2008BAD94B09）；上海市教育委員會優(yōu)秀青年教師基金項目（B－8101－09－0036）；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字（2009）第6－1號）；上海市教育委員會重點學科建設項目（J50704）。

＊

盧瑛（1971－），女，上海人，副教授，主要從事納米生物學與食品安全風險評估研究。Email：y－lu＠shou.edu.cn.