＊1 沼澤紅假單胞菌CQV97菌株對(duì)污染水體三氮去除特性研究

＊1沼澤紅假單胞菌CQV97菌株對(duì)污染水體三氮去除特性研究

在不同污染程度模擬水體中，利用沼澤紅假單胞菌CQV97，在厭氧光照條件下，研究了水體中氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量、菌體生物量和水體p H的變化關(guān)系.隨時(shí)間延長(zhǎng)，CQV97菌株對(duì)氨氮、硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮去除量增大，生物量增加，水體p H升高；隨氨氮濃度提高，生物量增加，氨氮低于33.2 mg／L能被完全去除，最大去除量達(dá)84.2 mg／L，水體p H維持在9.2～9.4；隨硝態(tài)氮濃度的升高，菌體生物量降低，濃度低于216.96 mg／L能被完全去除，p H維持在9.1～9.3.隨亞硝態(tài)氮濃度增加，菌體生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng)，生物量和p H升高幅度降低，濃度低于128.2 mg／L能被完全去除.結(jié)果表明，CQV97菌株對(duì)氨氮、硝氮和亞硝氮具有良好的去除能力.

沼澤紅假單胞菌；氨氮；亞硝態(tài)氮；硝態(tài)氮

0 引言

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展、餌料過度投放、化學(xué)藥劑和抗生素的濫用，使養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞［1－3］，水體的自凈能力大大下降.水體中氨氮和亞硝態(tài)氮等濃度升高，若不及時(shí)去除，不僅導(dǎo)致水生動(dòng)物中毒和致病，水產(chǎn)品質(zhì)量也會(huì)嚴(yán)重下降［3－5］，解決這一問題的關(guān)鍵是盡快恢復(fù)養(yǎng)殖水體的生態(tài)平衡.微生物修復(fù)技術(shù)在水體修復(fù)和養(yǎng)殖病害控制方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，是用于恢復(fù)養(yǎng)殖水體健康生態(tài)的一種有效策略［5－6］.但由于養(yǎng)殖水體環(huán)境和成分復(fù)雜多變，因此，搞清楚微生物菌種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及其影響因素是該項(xiàng)技術(shù)有效實(shí)施的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

目前用于修復(fù)和改善養(yǎng)殖水體的微生物菌種主要包括硝化細(xì)菌、不產(chǎn)氧光合細(xì)菌（簡(jiǎn)稱光合細(xì)菌）、諾卡氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌和酵母菌等類群［5］等.光合細(xì)菌是自然界水體自凈的主要功能類群，可在有光或黑暗、厭氧或有氧環(huán)境中將異養(yǎng)菌分解大分子有機(jī)物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（有機(jī)酸、有機(jī)醇、硫化氫及氨等）作為營養(yǎng)基質(zhì)而繁殖，既凈化了水質(zhì)，又不與養(yǎng)殖對(duì)象爭(zhēng)氧，細(xì)胞菌體還可被魚類等水生動(dòng)物所捕食，因而在水產(chǎn)養(yǎng)殖上顯示出多重功效.但與芽孢桿菌和酵母菌類相比，光合細(xì)菌在自然環(huán)境中生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，不能滿足現(xiàn)代養(yǎng)殖水體高效凈化的要求，需要予以補(bǔ)充，這也是多年來光合細(xì)菌等制劑在市場(chǎng)上經(jīng)久不衰的主要原因.

沼澤紅假單胞菌是我國允許使用的飼料級(jí)微生物之一，用于養(yǎng)殖水體的調(diào)節(jié)和修復(fù)的研究已有許多報(bào)道［7－12］，尚少見到在有機(jī)酸存在下，光合細(xì)菌對(duì)氨氮、亞硝氮和硝氮去除規(guī)律的系統(tǒng)研究.本文選用一株對(duì)多環(huán)芳烴菲和多種有機(jī)物、氮化物和硫化氫具有降解和轉(zhuǎn)化能力的沼澤紅假單胞菌CQV97菌株［13］為研究對(duì)象，分別配制氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮污染程度不同的含有乙酸鈉的模擬污染水體，在人工控制的厭氧光照環(huán)境中研究了該菌株在小分子有機(jī)酸存在下，對(duì)水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的去除規(guī)律和特性，為微生物水質(zhì)凈化調(diào)節(jié)劑的實(shí)際應(yīng)用提供參考.

1 材料及方法

1.1 菌種來源

沼澤紅假單胞菌CQV97（RhodopseudomonaspalustrisCQV97），GenBank登錄號(hào) EU882154，本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存在海洋資源微生物菌種保藏中心（MCCC 1I00117）.

1.2 主要試劑

氯化銨、亞硝酸鈉、硝酸鉀均為國產(chǎn)優(yōu)級(jí)純?cè)噭粺o水乙酸鈉、氯化汞、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酰胺、鉬酸銨、硝酸鉍等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?

1.3 培養(yǎng)基和CQV97菌劑的制備

配制改良的Ormerod培養(yǎng)基［14］，用2.46 g乙酸鈉取代其中的6.0 g·L－1蘋果酸鈉，接種量為5%（V／V），接種后培養(yǎng)瓶用無菌培養(yǎng)基充滿，于30℃、3 000 lx光照厭氧培養(yǎng)4 d，得到CQV97制劑.

1.4 溶液配制

精確稱量，用無氨水定容，配制氯化銨、硝酸鈉和亞硝酸鈉溶液，濃度均為2.25 mol／L，溶液分別用0.22 μm濾膜過濾除菌備用.

1.5 模擬污染水體樣品的制備

1.6 氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的去除

1.7 生物量的測(cè)定

采用比濁法測(cè)定，以660 nm處的光密度（OD660）表示菌體生物量.在光程為1 cm比色杯中于UV－3200PCS紫外可見分光光度計(jì)（MAPADA）測(cè)定光密度.

1.8 p H測(cè)定

用METTLER－TOLEDO－320 p H計(jì)測(cè)定樣品的p H值.

1.9 氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的測(cè)定和計(jì)算

其中：C0為初始濃度，Ct為終濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株CQV97對(duì)氨氮的去除特性

菌株CQV97在污染程度不同的氯化銨－乙酸鈉模擬水體中，水中氨氮含量、p H變化以及菌體增殖隨時(shí)間變化過程見圖1（P559）.從圖1可以看出，在10 d處理期內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，不同污染程度水體中的氨氮濃度均降低（圖1A），菌體生物量升高（圖1B），水體p H升高（圖1C）.菌體細(xì)胞增殖速率較快，4 d進(jìn)入平衡期，4 d內(nèi)氨氮去除速率較快，p H上升幅度較大，之后氨氮去除速率、菌體增殖速率、p H升高幅度都減緩并趨于穩(wěn)定.在污染濃度較低的氨氮（33.23 mg／L）水體中，氨氮在4 d內(nèi)被耗盡，菌體不再增殖，而污染程度較高水體中的氨氮?jiǎng)t尚未耗盡，菌體繼續(xù)緩慢增殖，p H也隨著氨氮濃度的升高而上升幅度減緩，最終趨于相同.

圖1 模擬污染水體中NH＋4－N（A）、菌體增殖（B）及水體p H（C）隨時(shí)間變化曲線Fig.1 Changes of NH＋4－N concentration（A），cell growth（B）and p H（C）in different polluted water sample.

水樣中起始氨氮濃度對(duì)氨氮去除量（r）、去除率（R）、菌體生物量和p H影響見圖2（P559）.當(dāng)氨氮濃度為33.23～139.82 mg／L時(shí)，經(jīng)過10d處理，CQV97菌株的生長(zhǎng)未受到明顯抑制，菌體生物量增加，水樣p H升高并趨于一致（9.2～9.4）.氨氮的去除與起始濃度有明顯的關(guān)聯(lián)，隨氨氮濃度增加，去除量也增大；當(dāng)起始氨氮濃度為108.25 mg／L時(shí)去除量為84.21 mg／L，達(dá)到最大去除量.去除率則隨著氨氮濃度的增加而降低，在低濃度（≤33.23 mg／L）時(shí)，氨氮能被完全除去；當(dāng)氨氮濃度較高時(shí)，雖然去除量在增大，但水體中殘留量也相應(yīng)增大，去除率減小.結(jié)果表明：用CQV97菌株處理污染程度不同的氨氮－乙酸鈉模擬污染水體，水體中氨氮的去除量、菌體生物量和水體p H呈相關(guān)性，在氨氮被去除的同時(shí)，菌體生物量，p H也升高.待系統(tǒng)達(dá)到平衡后，隨起始氨氮濃度的增加，菌體對(duì)氨氮的去除量增加，逐漸達(dá)到最大去除量，菌體生物量和水體p H也隨之增加均達(dá)到最大值.在該封閉體系中，p H成為氨氮最大去除量和最大生物量的限制因素，若菌體生長(zhǎng)良好，p H未達(dá)到最大值，則氨氮能被完全清除.

圖2 起始濃度對(duì)氨氮去除量（1）、去除率（2）、菌體生物量（3）和p H（4）的影響Fig.2 Effects of initial concentrations ofN on removal amount（1），removal rate（2），cell growth（3）and p H （4）

2.2 菌株CQV97對(duì)硝態(tài)氮的去除特性

在不同污染程度的硝酸鈉－乙酸鈉模擬水體中加入CQV97菌劑光照厭氧處理7 d，硝態(tài)氮濃度、菌體增殖及水體p H隨時(shí)間的變化曲線見圖3（P560）.隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，水體中硝態(tài)氮含量不斷被去除（圖3A），菌體生物量和水體p H也逐漸升高（圖3B，3C）.2 d內(nèi)硝態(tài)氮的去除速率較低，菌體生長(zhǎng)處于潛伏期，但p H則明顯升高.隨后去除速率增加并很快達(dá)到100%，菌體生長(zhǎng)也進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，水體p H繼續(xù)上升，4 d后達(dá)到平衡.硝態(tài)氮起始濃度對(duì)硝態(tài)氮去除量、去除率、菌體生物量和水體p H的影響見圖4（P560）.當(dāng)水樣中硝態(tài)氮濃度為45.37～216.96（mg／L）時(shí)，隨著硝態(tài)氮濃度的升高，菌體生物量降低，但硝態(tài)氮均能被完全去除.初始硝態(tài)氮濃度低，水體p H升高幅度低，初始濃度高，p H升高幅度高，并趨于相同，維持在9.1～9.3之間.當(dāng)起始濃度達(dá)到216.96 mg／L時(shí)，p H進(jìn)一步升高.結(jié)果表明：在乙酸鹽環(huán)境中CQV97能夠較好地利用和轉(zhuǎn)化硝態(tài)氮并將其快速有效的去除，使水體p H升高.但與氨氮相比，硝態(tài)氮對(duì)菌體的生長(zhǎng)有一定的抑制作用.

2.3 CQV97對(duì)亞硝態(tài)氮的去除特性

對(duì)水生生物來說，亞硝酸鹽是有害物質(zhì).在亞硝酸鈉－乙酸鈉模擬污水中，加入CQV97菌劑光照厭氧處理，亞硝態(tài)氮濃度、菌體增殖及水體p H隨時(shí)間變化曲線見圖5，亞硝態(tài)氮起始濃度對(duì)硝態(tài)氮去除量、去除率、菌體生物量和水體p H的影響見圖6.如圖5所示（P560），在8 d內(nèi)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，水中亞硝氮濃度降低，菌體生物量升高，p H也升高.隨著初始亞硝態(tài)氮濃度升高，菌體生長(zhǎng)潛伏期延長(zhǎng)，生物量和水體p H降低（在7.2～7.5范圍內(nèi)）.如圖6所示（P561），當(dāng)初始亞硝態(tài)氮濃度在小于128.21 mg／L時(shí)，在8 d內(nèi)，隨著亞硝態(tài)氮濃度的升高，其去除量逐漸升高，去除率能達(dá)到100%；隨著初始濃度的進(jìn)一步升高，亞硝態(tài)氮的去除量和去除率逐漸降低.亞硝態(tài)氮對(duì)菌體生長(zhǎng)和水體p H升高具有抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制作用增強(qiáng).當(dāng)濃度大于175.21 mg／L時(shí)，菌體幾乎不生長(zhǎng)，p H升高幅度較低.結(jié)果表明：CQV97具有去除水體中亞硝態(tài)氮的能力，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，菌體生物量增加，水體中亞硝態(tài)氮的去除量升高，水體p H略有升高.亞硝態(tài)氮對(duì)CQV97生長(zhǎng)具有抑制作用，高濃度抑制作用明顯，但CQV97仍對(duì)亞硝態(tài)氮具有良好的利用和轉(zhuǎn)化能力.

圖3 模擬污染樣品中NO＋3－N含量（A）、菌體增殖（B）及水體p H（C）隨時(shí)間的變化曲線Fig.3 Changes of NO－3－N concentration（A），cell growth（B）and p H（C）in different polluted water

圖4 NO－3－N起始濃度對(duì)亞硝氮去除量（1）、去除率（2）、菌體生物量（3）和p H（4）的影響Fig.4 Effects of initial concentrations of NO－3－N on removal amount（1），removal rate（2），cell growth（3）and p H （4）

圖5 模擬污染樣品中NO－2－N含量（A）、菌體增殖（B）及水體p H（C）隨時(shí)間的變化曲線Fig.5 Changes of NO－2－N concentration（A），cell growth（B）and p H（C）in different polluted water

3 討論

圖6 NO－2－N起始濃度對(duì)亞硝氮去除量（1）和去除率（2）、菌體生物量（3）和p H（4）的影響Fig.6 Effects of initial concentrations of NO－2－N on removal

養(yǎng)殖水體中要求氨氮控制在0.025 mg／L以下，超過0.2 mg／L時(shí)，不僅危害水生生物，而且嚴(yán)重破壞水體生態(tài)環(huán)境.隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化發(fā)展，我國養(yǎng)殖水體中氨氮濃度嚴(yán)重超標(biāo)，甚至達(dá)到5 mg／L以上.亞硝酸鹽含量要求小于0.1 mg／L，但有些養(yǎng)殖水體含量超標(biāo)6倍以上.一般認(rèn)為，NO－3－N對(duì)水生動(dòng)物沒有不良影響［4］，但若濃度較高（60 mg／L）且維持較長(zhǎng)時(shí)間，則對(duì)生物會(huì)造成一定危害.若水體缺氧，則可能經(jīng)過銨異化硝酸鹽還原過程，產(chǎn)生氨氮和亞硝酸鹽危害水生動(dòng)物.因此，如何有效控制復(fù)雜養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮的濃度，是多年來一直困擾人們的難題.

沼澤紅假單胞菌已有多個(gè)菌株用于水質(zhì)調(diào)節(jié)作用的研究，但因使用的菌株不同，去除氨氮和亞硝態(tài)氮的能力有所差異，而且其去除能力受到光強(qiáng)、起始p H、溫度以及多種底物等多種因素的影響［8－12］.雖然有沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)過程中菌體生長(zhǎng)量與氨氮消耗關(guān)系的報(bào)道［11－12］，但尚不能解釋小分子有機(jī)酸鹽存在的養(yǎng)殖水體中，光合細(xì)菌對(duì)水體中氨氮、亞硝態(tài)氮和硝氮等物質(zhì)的去除量、菌體生長(zhǎng)和水體p H變化之間的關(guān)系和規(guī)律.本研究在含有乙酸鈉的體系中，著重闡明了沼澤紅假單胞菌對(duì)污染水體中氨氮、硝氮和亞硝氮去除過程中去除量、生物量和水體p H變化規(guī)律.結(jié)果表明，分離鑒定的能夠耐受和利用菲的CQV97菌株［13］，對(duì)水體中氨氮、硝氮和亞硝氮具有良好的去除能力和耐受能力，在氮素去除過程中的一般規(guī)律是氮素被去除，菌體生物量增加，水體p H升高；但對(duì)不同氮素去除過程中又呈現(xiàn)不同的特點(diǎn).菌體能夠利用這三態(tài)無機(jī)氮生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)的潛伏期長(zhǎng)短、生物量和水體p H升高的幅度不同，對(duì)氨氮和硝態(tài)氮利用能力較強(qiáng)，菌體生長(zhǎng)良好，水體p H升高幅度大，對(duì)亞硝態(tài)氮利用能力較低，菌體生物量較低.在一定濃度范圍內(nèi)，隨著水體中硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度升高，菌體生物量降低，但硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮均能被完全除去，則表明菌株CQV97對(duì)硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮也具有良好的轉(zhuǎn)化能力，但究竟是通過銨異化硝酸鹽還原（DNRA）還是通過反硝化作用轉(zhuǎn)化？是否能夠調(diào)控？還需要進(jìn)一步研究.同時(shí)也提示，光合細(xì)菌對(duì)亞硝態(tài)氮具有很強(qiáng)的去除能力，但由于受到亞硝態(tài)氮的抑制，在自然界生長(zhǎng)緩慢，因此需要適時(shí)補(bǔ)充光合細(xì)菌制劑以降低水體亞硝態(tài)氮含量，降低其對(duì)水生生物的毒性作用.

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趙玥，趙春貴＊，陳龑，楊素萍

（華僑大學(xué) 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門361021）

Denitrifying Characterizations from Inorganic Nitrogen－polluted Wastewater byRhodopseudomonaspalustrisCQV97

ZHAO Yue，ZHAO Chun－gui，CHEN Yan，YANG Su－ping
（DepartmentofBioengineeringandBiotechnology，HuaqiaoUniversity，Xiamen361021，China）

The relationship among removal amount and removal rate of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen，biomass as well as p H change in simulation wastewater polluted by different nitrogen compounds withRhodopseudomonaspalustrisCQV97 were investigated under anaerobically in the light.The results showed that strain CQV 97 had better capability of ammonia nitrogen removal.The removal amount and removal rate of ammonia nitrogen，biomass and p H increased during 10 d.With the increasing ammonia nitrogen concentration，the removal amount of ammonia nitrogen and biomass enhanced，p H reached at 9.2～9.4，but the apparent removal rate of ammonia nitrogen reduced.Less than 33.2 mg／L ammonia nitrogen could be completely removed.The maximal removal amount of ammonia nitrogen reached 84.2 mg／L.In the nitrate nitrogen－containing polluted wastewater，strain CQV97 could utilize，transform and rapidly and effectively remove nitrate nitrogen，cell growth and p H gradually increased while the nitrate nitrogen was constantly removed.With increasing nitrate nitrogen concentration，the biomass decreased，p H maintained at 9.1～9.3.The nitrate nitrogen could be removed completely and the maximal removal amount of nitrate nitrogen reached 216.96 mg／L.Strain CQV97 also was able to utilize and transform nitrite nitrogen in wastewater polluted by nitrite nitrogen，but cell growth showed lag phase，pH rised no more than 7.5.With increasing nitrite nitrogen concentration，the increasing rate of cell growth and p H reduced.The removal rate of nitrite nitrogen could reach 100%when the amount of nitrite nitrogen below 128.2 mg／L.In general，strain CQV97 has better removal ability to ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen.

Rhodopseudanonaspalustris；ammonia nitrogen；nitrate nitrogen；nitrite nitrogen

Q917.1

A

0253－2395（2012）03－0557－06＊

2011－12－03；

2011－12－19

國家自然科學(xué)基金 （31070054）；福建省自然科學(xué)基金（2010J01209）；中國科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金（KLUEH201005）

趙玥 （1987－），女，江蘇人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與開發(fā).＊通信作者：趙春貴，教授.E－mail：chungui＠hqu.edu.cn