轉(zhuǎn)MT工程菌的構(gòu)建及其對重金屬的抗性研究

儀慧蘭，呂品，吳麗華

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

轉(zhuǎn)MT工程菌的構(gòu)建及其對重金屬的抗性研究

儀慧蘭，呂品，吳麗華

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

利用重疊延伸PCR技術(shù)克隆金屬硫蛋白（MT）和綠色熒光蛋白（GFP）基因片段，并將兩基因融合連接構(gòu)建重組表達(dá)載體，采用氯化鋰法轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得工程菌株.熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，工程菌在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，說明GFP基因被正確表達(dá).在培養(yǎng)基中加入一定濃度的銅（1.0 mmol／L，1.5 mmol／L）、鉻（150μmol／L，200μmol／L）、鎘（120μmol／L，140μmol／L）、砷（40μmol／L，60μmol／L）化合物后，對照菌生長抑制，轉(zhuǎn)基因菌株長勢明顯好于對照菌，表現(xiàn)出對金屬離子的耐受性，說明工程菌過表達(dá)MT能夠增強(qiáng)宿主對重金屬離子的耐受性，提高菌株耐污能力，在微生物法凈化重金屬廢水中具有一定優(yōu)勢.

金屬硫蛋白;綠色熒光蛋白;重疊PCR;重金屬抗性

近年來，隨著城市化進(jìn)程的加快和工業(yè)的迅猛發(fā)展，大量未經(jīng)處理的工業(yè)廢水、城市垃圾和生活污水不斷排入環(huán)境中，使水體中的重金屬含量急劇升高.我國各大江河湖庫均受到不同程度的重金屬污染，底質(zhì)污染率高達(dá)80.1%，而且已經(jīng)影響到水體的質(zhì)量［1］.通過飲用重金屬超標(biāo)水，或食用重金屬超標(biāo)的蔬菜和糧食等，使人體攝入過量重金屬元素，機(jī)體代謝受到干擾，出現(xiàn)各種急性和慢性疾病.調(diào)查顯示，全球飲用水中約80%無法達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，在所有已知的人類疾病中70%～80%與水污染有關(guān)［2］.因此，對重金屬污染的治理顯得尤為重要.

金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）是一類富含半胱氨酸（Cys）的蛋白質(zhì)，其Cys的巰基與重金屬離子具有極強(qiáng)的結(jié)合力［3］，能結(jié)合重金屬離子形成無毒的配合物，具有解除重金屬毒性的功能.采用基因工程方法構(gòu)建MT高效表達(dá)載體轉(zhuǎn)化生物，可以獲得對重金屬離子具有較高耐受性和結(jié)合力的工程菌株和工程植物［4－7］，有望用于治理重金屬污染［4］.本文采用重疊延伸PCR技術(shù)［8－9］，將金屬硫蛋白和綠色熒光蛋白基因（Green Fluorescent Protein，GFP）進(jìn)行拼接，獲得了MT-GFP融合基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，以期篩選和獲得可用于重金屬污染治理的微生物菌株.

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（E.coli）DH5α，畢赤酵母（P.pastoris）GS115，酵母重組載體p CUP9K，重組質(zhì)粒p YX112-GFP，由本實(shí)驗室保存;重組質(zhì)粒pGEM-T-As MT2b由中國科學(xué)院植物研究所張海燕博士惠贈.

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：每升含10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl，p H 7.0.抗性篩選時用100 mg／L氨芐青霉素（Amp）.大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37℃，液體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為250 r／min.

YPD培養(yǎng)基：每升含20 g蛋白胨、10 g酵母粉、20 g葡萄糖.MD篩選平板：每升含13.4 g酵母基本氮源、0.000 4 g生物素、20 g葡萄糖、15 g瓊脂粉.酵母培養(yǎng)溫度為30℃，液體培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為200 r／min.

1.3 引物設(shè)計與合成

采用重疊延伸PCR法，根據(jù)金屬硫蛋白［10］和綠色熒光蛋白基因序列及載體p CUP9K上的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計并合成特異性引物（表1），使AsMt2b下游引物P2和GFP上游引物P3的32個堿基（下劃線部分）完全互補(bǔ)，在引物P1和P4中分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn).引物由上海生物工程有限公司合成.

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR amplification

1.4 重疊延伸PCR與重組載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒p GEM-T-As MT2b和p YX112-GFP為模板，分別用引物P1／P2和P3／P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用DNA凝膠回收試劑盒割膠回收.以回收的AsMT2b和GFP序列為模板，調(diào)整兩者摩爾濃度比為1∶1，采用重疊延伸PCR方法，用AsMT2b上游引物P1和GFP下游引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測并割膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物.

用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和重組載體p CUP9K，T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞，菌液涂布于含Amp的LB平板篩選陽性克隆.提取陽性克隆中的質(zhì)粒，用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切驗證，將構(gòu)建好的重組載體稱為p CUP9K-As MT2b-GFP.重組表達(dá)載體用BglⅡ單酶切線性化，回收大的目的片段，用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115.

1.5 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

畢赤酵母GS115接種于YPD液體中，培養(yǎng)至生長對數(shù)期（約108個細(xì)胞／m L）.取4 m L菌懸液12 000 r／min離心30 s收集細(xì)胞，加無菌水洗滌，12 000 r／min離心10 min后棄上清.加入0.1 mol／L的LiCl溶液重懸細(xì)胞，12 000 r／min離心15 s，吸去LiCl.加入30μL 0.1 mol／L LiCl溶液重懸細(xì)胞備用.

將鮭魚精單鏈DNA（2 mg／m L）沸水浴5 min，快速放于冰水中冷卻.取酵母感受態(tài)細(xì)胞12 000 r／min離心15 s，吸除LiCl.每個轉(zhuǎn)化樣品，按順序加入以下試劑：50%PEG 3350 144μL，1 mol·L－1LiCl 22μL，2 mg／m L鮭魚精單鏈DNA 15μL，線性化載體30μL.劇烈震蕩至細(xì)胞沉淀完全混勻，30℃孵育30 min，42℃水浴熱激20－25 min.6 000－8 000 r／min離心1 min，收集細(xì)胞，加300μL無菌水懸浮細(xì)胞.將菌液涂布于MD篩選平板，30℃培養(yǎng)2－4 d，直至長出酵母單菌落.挑取單菌落接種于YPD液體中過夜培養(yǎng)，提取基因組DNA，利用引物P1／P4進(jìn)行PCR驗證，電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.6 工程菌的熒光檢測

從平板上挑取工程菌單菌落，于YPD液體中培養(yǎng)過夜.取少量菌懸液在BX51型熒光顯微鏡（Olympus）下觀察，用藍(lán)光（波長460～480 nm）照射，觀察菌體有無熒光產(chǎn)生，并用DP72型顯微鏡數(shù)碼相機(jī)拍照.

1.7 工程菌對重金屬的抗性

分別制備含有銅（硫酸銅）、鉻（重鉻酸鉀）、鎘（氯化鎘）、砷（亞砷酸鈉）化合物的YPD平板，每種重金屬設(shè)置2個濃度梯度.挑取工程菌單菌落于YPD液體中活化后轉(zhuǎn)接于YPD液體中培養(yǎng)至生長對數(shù)期.離心收集菌體，用無菌水清洗2次后重懸，測OD600nm.將菌液以10倍梯度逐級稀釋，用移液器吸取不同濃度的菌液5μL，依次點(diǎn)樣于含重金屬的平板.以未轉(zhuǎn)基因的酵母和轉(zhuǎn)入空載體pCUP9K的酵母作為對照菌株，設(shè)置不添加重金屬的相同處理為對照，觀察和分析酵母的生長狀況.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體及工程菌的驗證

電泳檢測引物P1／P2和P3／P4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可見大小約為243 bp（圖1A，P397）和717 bp（圖1B）的單一條帶，與理論值一致，分別為AsMT2b和GFP基因片段.電泳檢測重疊延伸PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，可見約960 bp的單一條帶（圖1C），表明AsMT2b和GFP基因已經(jīng)融合連接.從陽性克隆中提取的質(zhì)粒用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，電泳檢測可見分子量為960 bp的As MT2b-GFP融合基因片段（圖1D），表明重組表達(dá)載體pCUP9K-As MT2b-GFP構(gòu)建成功.將重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作模板，用引物P1／P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得AsMT2b-GFP融合基因片段，表明工程菌株構(gòu)建完成.

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 DNA analysis by agarose gel electrophoresis（A）M：150 bp marker 1：As MT2b基因擴(kuò)增產(chǎn)物 （B）M：150 bp marker 1：GFP基因擴(kuò)增產(chǎn)物（C）M：150 bp marker 1：重疊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（D）M：10 000 bp marker 1：EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pCUP9K-As MT2b-GFP產(chǎn)物

2.2 工程菌的熒光特征

熒光顯微鏡下用波長460－480 nm的藍(lán)光激發(fā)，可以觀察到工程菌菌體發(fā)出的綠色熒光（圖2），其熒光位置與普光下菌細(xì)胞位置一一對應(yīng)，表明As MT2b-GFP融合蛋白在工程菌株中獲得正確表達(dá).

圖2 工程菌的熒光顯微鏡觀察（物鏡20×） （A）普通光學(xué)顯微鏡 （B）熒光顯微鏡Fig.2 Imaging of green fluorescence proteins engineered to yeast cells（A）under a light microscope （B）under a fluorecence microscope

2.3 工程菌對重金屬的耐受性

檢測轉(zhuǎn)AsMT2b基因的工程菌株對4種重金屬（銅、鉻、鎘、砷）的抗性.結(jié)果顯示，在未添加重金屬的平板上，工程菌的生長狀況與對照菌大致相同;在添加重金屬的平板上，3個酵母菌株的生長均受到抑制，高濃度組抑制作用較強(qiáng)，轉(zhuǎn)MT工程菌生長明顯好于兩個對照菌.在含低濃度銅（1.0 mmol／L）、鉻（150μmol／L）、鎘（120μmol／L）的平板上，對照菌雖受抑制但可以生長分裂，工程菌生長無明顯抑制，在含高濃度銅（1.5 mmol／L）、鉻（200μmol／L）、鎘（120μmol／L）的平板上，對照菌無可見菌落形成，即細(xì)胞生長分裂完全抑制，而工程菌能夠生長分裂形成菌落和菌斑.在所檢測的濃度范圍內(nèi)，工程菌對銅、鉻、鎘的耐受性顯著增強(qiáng)，對砷的耐受性影響較小.砷濃度60μmol／L時工程菌比對照菌長勢略好，砷濃度40μmol／L時兩者差異不明顯.這表明，工程菌過表達(dá)金屬硫蛋白As MT2b基因能夠增強(qiáng)宿主對銅、鉻、鎘離子的耐受性，使菌體的耐污性明顯提高.

圖3 工程菌株對不同重金屬的耐受性Fig.3 Tolerance of engineered yeast strain to copper，cadmium，chromium and arsenic

3 結(jié)論

重疊延伸PCR技術(shù)使用具有互補(bǔ)末端的引物，使兩個目的基因形成重疊鏈，在擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將兩個目的基因融合連接起來，能夠在體外進(jìn)行基因重組，而且避免不必要的酶切和連接，重疊PCR技術(shù)的關(guān)鍵在于重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計［11］.利用本文設(shè)計的特異性引物，成功擴(kuò)增出金屬硫蛋白（MT）和綠色熒光蛋白（GFP）基因片段，并將其連接獲得MT-GFP融合基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體p CUP9KAs MT2b-GFP，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115獲得工程菌株.

用熒光顯微鏡觀察到工程菌中GFP的特異性綠色熒光，證實(shí)了MT-GFP融合基因在工程菌株中的正確表達(dá).通過平板培養(yǎng)檢測轉(zhuǎn)金屬硫蛋白AsMT2b基因的工程菌株對4種重金屬（銅、鉻、鎘、砷）的抗性，發(fā)現(xiàn)工程菌對銅、鉻、鎘離子的抗性明顯增強(qiáng)，這說明工程菌過表達(dá)AsMT2b基因能夠增強(qiáng)宿主對銅、鉻、鎘離子的耐受性，使菌體耐污能力明顯提高.用微生物法處理重金屬廢水時，因廢水中往往含有多種有害成分，對微生物細(xì)胞具有毒性作用，耐污性較強(qiáng)的菌株更適于對廢水的凈化處理，因此，本文構(gòu)建的工程菌用于微生物法凈化重金屬廢水具有一定的優(yōu)勢.

［1］周懷東，彭文啟.水環(huán)境與水環(huán)境修復(fù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］陳學(xué)傲.環(huán)境衛(wèi)生學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.

［3］田曉麗，郭軍華.金屬硫蛋白的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，2005，32（2）：119-124.

［4］Thomas J C，Davies E C，Malick F K，etal.Yeast Metallothionein in Transgenic Tobacco Promotes Copper Uptake from Contaminated Soils［J］.BiotechnologyProgress，2003，19（2）：273-280.

［5］Suleman A，Shakoori A R.Evaluation of Physiological Importance of Metallothionein Protein Expressed byTetrahymenaCadmium Metallothionein 1 （TMCdl）Gene inEscherichiacoli［J］.JournalofCellularBiochemistry，2012，113（5）：1616-1622.

［6］Ruiz O N，Alvarez D，Gonzalez-Ruiz G，etal.Characterization of Mercury Bioremediation Bytransgenic Bacteria Expressing Metallothionein and Polyphosphate Kinase［J］.BMCBiotechnology，2011，11：82.

［7］Shestivska V，Adam V，Prasek J，etal.Investigation of the Antioxidant Properties of Metallothionein in Transgenic Tobacco Plants using Voltammetry at a Carbon Paste Electrode［J］.InternationalJournalofElectrochemicalScience，2011，6：2869-2883.

［8］Warrens A N，Jones M D，Lechler R L.Splicing by Overlap Extension by PCR Using Asymmetric Amplification;an Improved Technique for the Generation of Hybrid Proteins of Immunological Interest［J］.Gene，1997，186（1）：29-35.

［9］Shevchuk N A，Bryksin A V，Nusinovich Y A，etal.Construction of Long DNA Molecules Using Long PCR-based Fusion of Several Fragments Simultaneously［J］.NucleicAcidsResearch，2004，32（2）：e19.

［10］張海燕，徐文忠，戴文韜，等.大蒜金屬硫蛋白家族新成員As MT2b在鎘離子脅迫下的功能分析［J］.科學(xué)通報，2006，51（3）：309-315.

［11］徐芳，姚泉洪，熊愛生，等.重疊延伸PCR技術(shù)及其在基因工程上的應(yīng)用［J］.分子植物育種，2006，4：747-750.

Engineered Yeast Cells Displaying Metallothionein Enhance Self Tolerance to Environmental Heavy Metals

YI Hui-lan，LU..Pin，WU Li-hua

（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

The metallothionein（MT）gene and green fluorescent protein（GFP）gene were cloned，modified and fused by gene splicing by overlap extension PCR technique，and then one recombinant expression vector was constructed and transformed intoP.pastoris.The engineered yeast cells could emit the green fluorescence under a fluorescence microscope，indicating the correct expression ofMT-GFPfusion gene in yeast cells.On YPD medium containing respectively copper（1.0 mmol／L，1.5 mmol／L），cadmium （120μmol／L，140μmol／L），chromium （150μmol／L，200μmol／L）and arsenic（40μmol／L，60μmol／L）ions，the engineered yeast strain cells could grow and divide to form some colonies，but the control strains without exogenousMTgene can not grow normally to form a clear colony，especially after exposed to higher concentrations of the metals.The results showed that transgenic yeast cells expressed the metallothionein gene increased the self tolerance to environmental heavy metals，which might be a useful material for wastewater treatment.

metallothionein;green fluorescent protein;overlap extension PCR;heavy metal tolerance

0253-2395（2012）02-0395-05

Q785

A

2012-01- 13;

2012-02-27

山西省工業(yè)攻關(guān)項目（20080321084）;太原市明星計劃項目（08121012）

儀慧蘭（1963－），女，山西新絳人，博士，教授，主要研究方向為環(huán)境生物學(xué).E-mail：yihuilan＠yahoo.com.cn