L-精氨酸合成及高產菌選育與發(fā)酵研究進展

于向鵬，劉靜，劉潔，金海如

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004)

1929年廣田氏研究魚精蛋白發(fā)現(xiàn)其含大量精氨酸，約占總氨基酸的80%，因此命名為精氨酸(arginine，Arg)，精氨酸最初是在羽扇豆苗提取物中得到的［1］。精氨酸是一種人體半必需的堿性氨基酸，具有特殊的生理生化功能，被廣泛應用于食品及醫(yī)藥工業(yè)中［2］。精氨酸不僅對氨中毒性肝昏迷、病毒性肝炎的治療效果顯著［3］，還通過精氨酸-一氧化氮通路所產生的一氧化氮，調節(jié)一系列免疫過程，對肌體起著全方位的保護作用［4］。創(chuàng)傷后肌體補充適當?shù)耐庠碙-精氨酸，可以促進傷口愈合，提高免疫水平［5］。此外，研究表明L-精氨酸在男性生殖功能中起到作用［6］，也有抗粥樣動脈硬化、調節(jié)血壓的功能［7-8］。在生化方面，精氨酸是尿素循環(huán)及合成聚胺、肌酸的代謝中間物，也是合成胞漿蛋白與核蛋白的前體。目前精氨酸最高產量為96 g/L［9］。國內菌株產酸水平和遺傳穩(wěn)定性依然處于劣勢，且使用菌種單一，易被噬菌體污染。在重點綜述真菌合成精氨酸研究進展基礎上，對精氨酸發(fā)酵前景做了探討，并根據(jù)實際情況提出了新的建議，為篩選高產精氨酸菌株提供新的解決途徑。

1 精氨酸高產菌選育及發(fā)酵研究進展

1.1 高產精氨酸菌株選育進展

自然界中產精氨酸的正常菌株代謝會維持在一個平衡的穩(wěn)定狀態(tài)，故菌株精氨酸產量低，不利于工業(yè)生產。必須打破合成途徑的平衡狀態(tài)，獲得“不正?！钡木?，提高精氨酸產量。

精氨酸的合成是一條沒有分支的途徑，其關鍵酶受終產物精氨酸的反饋抑制，因此，傳統(tǒng)選育以UV、NTG、DES等理化誘變劑處理優(yōu)良的出發(fā)菌株，主要通過篩選具有精氨酸結構類似物抗性的變異菌株，解除精氨酸對合成途徑的反饋調節(jié)，從而提高產量。也可以構建精氨酸工程菌獲得優(yōu)良菌株。這方面早期研究已有文獻進行了詳細的綜述［10］。

最早有關利用基因工程手段育種的報道是滕亦等將含精氨酸生物合成酶系基因群及質粒pEArgl導入到宿主谷氨酸棒桿菌ATCC13032，哈庫利棒桿菌ATCC13868及黃色短桿菌ATCC14067中，構建精氨酸工程菌。最近，Ikeda等［11］以3株谷氨酸棒桿菌突變株為出發(fā)菌株進行基因重組，獲得高產精氨酸菌株。表明將ΔargR和argB26組合并導入野生型C.glutamicum中，可得到精氨酸高產菌株。來源于亮氨酸生產菌株的基因leuC456，能夠提高氨基酸包括精氨酸操縱子的活性。

國內楊新平等［12］利用含有argA、sacC編碼序列的pARG25的重組質粒和帶標記的大腸埃希菌LGE-28中，構建成了產精氨酸的基因工程菌，使糖轉化率超過40%，可產精氨酸30 g/L以上，且雜酸量很低。近兩年，已利用鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum)SYPA構建出多株精氨酸工程菌。饒志明等［13］將argH構建鈍齒棒桿菌重組穿梭表達質粒pJC1-tacargH，并將其通過電擊轉化法轉入C.crenatum SYPA中，分析其發(fā)酵產精氨酸，結果表明與出發(fā)菌株相比精氨酸產量提高了約14.2%，達40.9 g/L。最近，Xu等［14］對關鍵酶N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)的序列進行定點誘變，形成復合突變位點NAGKM3，進而將其轉入Corynebacterium crenatum SYPA-CCB，構建Corynebacterium crenatum SYPA-CCBM3精氨酸工程菌，具有抗精氨酸反饋抑制的特性。測試該工程菌精氨酸產量可達45.6 g/L。Dou等［15］對鈍齒棒桿菌突變株的雙功能酶鳥氨酸乙?；D移酶進行研究，并將其轉入Corynebacterium crenatum SYPA5-5過表達，也使精氨酸產量得到提高。

1.2 精氨酸發(fā)酵工藝研究進展

改進發(fā)酵是提高精氨酸產量的另一種有效措施，在優(yōu)化發(fā)酵工藝上，一方面是優(yōu)化培養(yǎng)基配方，另一方面是優(yōu)化發(fā)酵條件。如利用合適的軟件設計優(yōu)化方案，調節(jié)初始糖濃度及補加硫酸銨，改善供氧策略及添加前體物質［16］。黃繼紅等［17］針對生物發(fā)酵過程的復雜性，利用細胞分析儀研究了產精氨酸菌群細胞活性能，解決了原位監(jiān)測的困難，為發(fā)酵工藝優(yōu)化帶來了便利。

2 真菌中精氨酸合成及調控研究

20世紀六七十年代國外以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)2種模式生物作為研究對象，對精氨酸合成做了廣泛研究。真菌中精氨酸的合成過程一般可分為3個主要部分:由谷氨酸經(jīng)一系列酶作用形成鳥氨酸，氨甲酰磷酸的合成，鳥氨酸與氨甲酰磷酸合成精氨酸。精氨酸合成途徑見圖1。

2.1 精氨酸的合成

2.1.1 鳥氨酸的合成在2種模式生物中，鳥氨酸的合成場所都是線粒體［18-19］。首先，乙酰-CoA的乙?；谝阴９劝彼岷铣擅复呋罗D移給谷氨酸形成N-乙酰谷氨酸;然后，N-乙酰谷氨酸激酶和N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶催化乙酰谷氨酸通過一個不穩(wěn)定的磷酸化的中間物形成乙酰谷氨酸半醛，這2種酶由單一復合位點合成［20］;接著，由乙酰鳥氨酸氨基轉移酶和乙酰鳥氨酸谷氨酸?；D移酶催化釋放出鳥氨酸，從而使N-乙酰谷氨酸得到再生。利用?；D移酶催化再生N-乙酰谷氨酸要比N-乙酰谷氨酸合成酶催化谷氨酸生成N-乙酰谷氨酸節(jié)省能量，有利于菌體生長繁殖。

乙酰-CoA被轉移給谷氨酸后，便在精氨酸合成途徑中合成一系列的乙?；闹虚g物，它們可被合成鳥氨酸的酶特異性識別而進入精氨酸途徑，非乙?；臅M入脯氨酸合成途徑。

2.1.2 氨甲酰磷酸的合成這一步反應粗糙脈孢菌發(fā)生在線粒體中，釀酒酵母發(fā)生在細胞質內［21-23］。催化氨甲酰磷酸合成的酶在動物和真菌內發(fā)現(xiàn)了2種，它們由不同基因所編碼［24］。一種特異性作用于精氨酸途徑稱為CPS-A，而另一種則特異性作用于嘧啶途徑稱為CPS-P。CPS-A利用氨基氮，2 mol三磷酸腺苷(ATP)Mg2+，碳酸氫鹽合成氨甲酰磷酸、無機磷酸和ADP［25］。CPS-A包含1個大亞基和1個小亞基，由分開的基因編碼。它們的功能也各不相同，小亞基分裂谷氨酸，為下一步獲得酰胺態(tài)氮;大亞基完成其他的反應。釀酒酵母中精氨酸途徑的氨甲酰磷酸合成酶的調控有2種機制。一種是對CPS-A特異的，受精氨酸調控。這種特異機制調控編碼小亞基的基因cpaⅠ的表達。另一種是普遍的，它控制除精氨酸序列之外的許多氨基酸合成途徑的酶。與特異調控途徑相反，一般調控途徑即調控cpaⅠ又調控cpaⅡ的表達［26］。

圖1 粗糙脈胞菌中精氨酸合成途徑Fig.1 The path of arginine biosynthetic pathway of Neurospora crassa

2.1.3 鳥氨酸與氨甲酰磷酸合成精氨酸這個過程需要3種酶:鳥氨酸氨甲?；D移酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶。在粗糙脈孢菌中第1個酶位于線粒體內。在釀酒酵母中3種酶均位于細胞質內，所以線粒體中合成的鳥氨酸通過ARG-11基因編碼的載體蛋白運輸?shù)桨|內與氨甲酰磷酸合成精氨酸［27］。

鳥氨酸氨甲?；D移酶催化氨甲酰磷酸的氨甲?；D移到鳥氨酸的δ-氨基上，生成瓜氨酸和無機磷酸。在精氨琥珀酸合成酶催化的反應中，瓜氨酸、ATP-Mg2+、天冬氨酸和酶形成四聚體，進而釋放出AMP、PPi-Mg2+和精氨酸琥珀酸。在2種生物的細胞內，精氨酸對此酶均有抑制性［28］。精氨琥珀酸經(jīng)一步裂解酶催化的可逆反應生成精氨酸和延胡索酸。

2.2 真菌中精氨酸代謝的調控

2.2.1 一般控制系統(tǒng)在釀酒酵母中存在一個由多種氨基酸調控相耦合的調控方式，它是由一種氨基酸缺乏引起的多重氨基酸合成路徑中酶的去抑制復合調控系統(tǒng)。這種交叉路徑調控被稱作一般氨基酸控制。這種調控方式控制7種不同氨基酸合成路徑中至少30種氨基酸的表達。一般控制是在粗糙脈孢菌中發(fā)現(xiàn)的，最初也稱為交叉途徑控制［29］，并且現(xiàn)在這個名字仍在使用。

一般控制系統(tǒng)依賴每個協(xié)同調節(jié)的結構基因上游的短的重復核苷酸序列—5'-TGACTC-3'［30］。此序列的功能是正調控位點并且是GCN4蛋白的識別序列。GCN4的產物與特異序列5'-TGACTC-3'結合從而起作用。在釀酒酵母中，氨基酸缺乏時GCN1、GCN2、GCN3被激活，關閉GCD1，GCN4的mRNA被翻譯，產物GCN4蛋白刺激氨基酸合成基因表達。氨基酸缺乏或tRNA卸載是導致去抑制的信號。在粗糙脈孢菌中起到類似GCN1、GCN2、GCN3作用的是CPC-1。在許多被測序的精氨酸基因的5'端非編碼區(qū)都發(fā)現(xiàn)了這個序列，并且都受一般氨基酸調控。

另外，一些負調控作用的GCD基因產物是維持氨基酸非缺乏條件時抑制所需要的。在一般控制中GCN4表達在翻譯水平上受其他GCN和GCD順式作用因子的調節(jié)。gcn－和gcd－調節(jié)突變的表型說明GCN+和GCD+基因分別編碼受一般控制的結構基因的正負順勢作用因子。

2.2.2 精氨酸特異調控在酵母中，協(xié)調所有氨基酸合成的調控發(fā)生在轉錄水平，而精氨酸特異調控發(fā)生在轉錄后水平。釀酒酵母中涉及到精氨酸合成與分解的基因的表達由特異的多功能因子調控，它們根據(jù)氨基酸、氮源、精氨酸的有無或作為激活劑或作為抑制劑。4種蛋白(Arg80、Arg81、Mcm1和ARG82)通過對精氨酸的應激，抑制合成基因和誘導分解基因，從而協(xié)調精氨酸代謝基因的表達。Arg80、Arg81、Mcm1形成一個復合蛋白［31］，與存在于精氨酸協(xié)同調控基因的啟動子中被稱作精氨酸盒的DNA序列相互作用。只有精氨酸與Arg81結合，復合體才能與DNA序列相互作用。其中ARG82的作用是固定Arg80及Mcm1蛋白，Arg81起到傳感器的作用。另外，只要有外部氮源，分解代謝基因CAR1和CAR2的表達就被抑制，這是由帶有組蛋白脫乙酰酶活性的復合體Ume6-Sin3-Rpd3調控的［32］。當細胞的生長環(huán)境缺乏氮源時，CAR1將被激活。

在粗糙脈胞菌中，存在精氨酸特異性翻譯調控，它具有阻遏作用。arg-2上游開放閱讀框架(uORF)在調控中起關鍵作用，粗糙脈胞菌轉錄物包含一個指定21個殘基的導肽的上游開放閱讀框架。精氨酸可增加核糖體延宕，從而減少從下游起始密碼子的翻譯［33］。

2.3 真菌產精氨酸研究

李兆蘭等［34］分別測定7種真菌菌絲及發(fā)酵液中17種氨基酸的含量，多數(shù)真菌中精氨酸產量都很高，其中硫黃菌發(fā)酵液中精氨酸含量最高，而裂褶菌菌絲中精氨酸含量最高，可達1.69 g/100 g菌絲體。最近田萌萌等［35］以大蔥(Allium fistulosum)為宿主植物，接種叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌Glomus intraradices，經(jīng)過試驗處理，通過測定根外菌絲(Extraradical mycelium，ERM)和菌根中精氨酸的含量，探究葡萄糖、根浸出液對AM真菌吸收不同形式外源氮產生精氨酸的影響，其中以精氨酸為外源氮時，菌根中精氨酸產量可達4.29 mg/g菌絲體。進一步研究不同菌根真菌的精氨酸產量發(fā)現(xiàn)以聚叢球囊霉菌最高，為2.33 mg/g菌根，而根內球囊霉的根外菌絲精氨酸產量最高，為1.36 mg/g根外菌絲。

3 結論

據(jù)統(tǒng)計2007年歐美及日本的精氨酸總產量14 000 t，而我國制劑藥用L-精氨酸產量為1 585 t，預計2012年將達到3 300 t，如此巨大增長的需求量主要依靠發(fā)酵法生產來滿足。優(yōu)良的精氨酸高產菌株是發(fā)酵工業(yè)應用的基礎，因此選育高產菌是研究的重點。目前，精氨酸發(fā)酵生產遇到了難以獲得優(yōu)良菌株的瓶頸，傳統(tǒng)選育手段已很難滿足當前的趨勢。也有人提出利用基因工程技術刪除涉及精氨酸分解的ast操作子或者參與精氨酸攝入的argT和artU 2個基因，或者增加幫助精氨酸分泌的argO的表達的建議。國內也做了很多構建工程菌的研究，目前產量仍然未達到工業(yè)應用水平。近些年真菌資源已被廣泛重視，很多真菌被應用于發(fā)酵生產，在產精氨酸菌種選育的研究中很少使用真菌，因此還可以考慮以真菌來選育高產精氨酸菌種。本實驗室已經(jīng)做了部分真菌發(fā)酵生產精氨酸的研究，在目前發(fā)酵條件下，其產量可達菌絲體干重的2%左右，且發(fā)酵液中也含一定量精氨酸。

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