四種植物提取液抑菌作用的分析

劉 偉，王 冰，周麗威，宋金枝，顧地周

(通化師范學(xué)院 生物系，吉林 通化 134002)

植物合成芳香簇化合物的能力幾乎是無限的，其中大部分是酚類物質(zhì)和它們的衍生物[1].其中絕大多數(shù)是次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在分離到的至少有12000種以上，約占自然界中總數(shù)的10%[2].其中的大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾體、酚類、獨(dú)特的氨基酸和多糖等均具有殺蟲或抗菌活性[3].

長白山區(qū)地處北溫帶和寒溫帶氣候類型，植物資源非常豐富.我們選取了四種長白山區(qū)常見的植物作為研究對象，研究其對三種植物病原細(xì)菌的殺菌活性.其中白屈菜、胡桃楸、細(xì)葉杜香為長白山區(qū)野生有毒植物資源[4].白屈菜為罌粟科白屈菜屬植物，主要有效成分是生物堿類物質(zhì)，包括白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿、小檗堿、黃連堿等[5].已有關(guān)于其對抑制植物病原真菌活性的研究[6]，發(fā)現(xiàn)其對蘑菇根霉病菌菌絲生長有顯著的抑制作用；也有研究白屈菜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌抑菌活性的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)白屈菜提取液對這些病原菌有明顯的抑制作用[7].白屈菜的有效成分中，以白屈菜紅堿的研究最多，范海延等人對白屈菜紅堿進(jìn)行了提取并測定了其抑菌活性，發(fā)現(xiàn)它對多種植物病原真菌有抑菌活性[8].同時(shí)，也有研究發(fā)現(xiàn)，胡桃楸[9]、細(xì)葉杜香[10]、蒲公英[11]具有一定的抑菌活性.但對植物病原細(xì)菌的抑菌活性研究相對較少，本文利用上述四種植物提取物，對三種黃單胞菌屬植物病原細(xì)菌的抑菌作用進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用植物源殺菌劑提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物.白屈菜(ChelidoniummaiusL.)、蒲公英(Taraxacum)，采于通化師范學(xué)院附近山區(qū)；細(xì)葉杜香(LedumpalustreL.var)、胡桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)采于白雞腰國家自然保護(hù)區(qū).白屈菜取地上部分(莖葉)和地下部分(根)分開采集、處理；蒲公英取全草；細(xì)葉杜香和胡桃楸取葉.

供試菌株.甘藍(lán)黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)、水稻細(xì)條病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)由廣西大學(xué)生科院提供.

培養(yǎng)基.NYGB培養(yǎng)基用于甘藍(lán)黑腐病菌的培養(yǎng).OB培養(yǎng)基用于水稻白葉枯病菌的培養(yǎng).NB培養(yǎng)基用于水稻細(xì)條斑病菌的培養(yǎng).

1.2 試驗(yàn)方法

(1)植物材料的采集及提取液的提取.將采集的植物洗凈泥土和雜質(zhì)，置于室內(nèi)陰涼通風(fēng)處陰干，干燥后的植物用粉碎機(jī)粉碎，過篩.每種植物各稱取100g，加入2L蒸餾水浸泡12h后，文火熬三次，后兩次均加水1L熬到200ml左右，合并濾液，用多層紗布過濾，再用濾紙過濾，加熱濃縮至100ml，制成水劑.用細(xì)菌過濾器過濾兩次，得到質(zhì)量濃度為0.5g/ml的植物提取液的母液，放4℃冰箱中備用.

(2)菌懸液的制備.將金甘藍(lán)黑腐病菌、水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)條病菌分別接種NYG、OB、NB液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm搖床過夜培養(yǎng)，選取處于對數(shù)生長期的菌體，測OD600，調(diào)整OD600=1.0，稀釋涂板，菌落計(jì)數(shù).

(3)最低抑菌濃度的測定.取供試藥液母液，濃度為0.5g/ml，以此濃度用相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行2倍稀釋，以培養(yǎng)基加入相應(yīng)藥液為空白對照，培養(yǎng)基加入菌液做陰性對照，培養(yǎng)基加入菌液和卡那霉素作為陽性對照.在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入相應(yīng)量的培養(yǎng)基和藥液，配成濃度依次為0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml的溶液，分別加入20μl菌液(菌液濃度約為108cfu/ml)，在96孔板內(nèi)混合后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，空白對照和陽性對照應(yīng)為沒有渾濁的澄清溶液，陰性對照為渾濁液體，沒有渾濁孔中的最低藥液質(zhì)量濃度為樣品對供試細(xì)菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC).所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次.

(4)帶藥培養(yǎng)基的制備.取已制備好的植物提取物母液4ml加入到6ml已滅菌的固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿中配成終濃度為0.2g/ml的固體帶藥培養(yǎng)基.其他濃度依此方法分別配成終濃度為0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml的固體帶藥培養(yǎng)基.

表1 4種植物對三種植物病原菌的最低抑菌濃度

注：+表示細(xì)菌能夠正常生長，-表示細(xì)菌不能夠正常生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

采用96孔板法[12]測定了四種植物對三種植物病原細(xì)菌的抑菌作用，同時(shí)用帶藥平板法對最低抑菌質(zhì)量濃度進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果與96孔板法基本一致.白屈菜、胡桃楸、蒲公英的提取液對三種植物病原細(xì)菌都有一定的抑菌活性，而細(xì)葉杜香的提取液對三種植物病原細(xì)菌都沒有抑菌活性.白屈菜(莖葉)和蒲公英提取液的抑菌效果相似，抑菌效果最好，胡桃楸和白屈菜(根)提取液的效果稍差.

2.2 四種植物對植物病原細(xì)菌的最低抑菌濃度

通過最低抑菌濃度測定可知(見表1)，白屈菜(莖葉)和蒲公英提取液對Xcc、Xoc、Xoo三種植物病原細(xì)菌的最低抑菌濃度均為0.1g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml，其中對Xoo的抑菌效果最好；白屈菜(根)提取液對三種植物病原細(xì)菌的最低抑菌濃度均為0.2g/ml；胡桃楸提取液對三種植物病原細(xì)菌的最低抑菌濃度分別是0.1g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml，其中對Xoc的抑菌效果要差一些.

3 結(jié)論與討論

通過四種植物提取液對三種黃單胞菌屬植物病原細(xì)菌抑菌活性的測定，發(fā)現(xiàn)白屈菜、胡桃楸和蒲公英對三種細(xì)菌都有不同程度的抑菌效果，而細(xì)葉杜香在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)有抑菌活性.不同植物提取液對三種細(xì)菌的抑菌活性相差較大，而同一植物對三種細(xì)菌的抑菌活性基本相近.雖然目前對白屈菜及其生物堿抑菌活性研究較多，但對其不同部位有效成分含量尚沒有深入研究，本研究中其地上部分提取液的抑菌效果要好于地下部分，其地上部分有效成分含量應(yīng)高于地下部分.此前，胡桃楸在醫(yī)藥方面開展了一些研究，通過本文說明其對植物病原細(xì)菌也有一定的抑菌活性，對其抑菌活性成分及抑菌機(jī)理方面的研究有待開展.已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道蒲公英對植物病原真菌具有顯著的抑菌作用，本研究豐富了蒲公英的抑菌譜，可為其開發(fā)提供參考依據(jù).

不同植物所含有效成分各異，對于不同提取方法得到的有效成分含量也不同，所以利用不同提取方法提取有效成分，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的效果有所差異.為了防止高溫導(dǎo)致有效成分的分解，在對植物樣品烘干時(shí)避免使用高溫烘干、提取液除菌時(shí)使用細(xì)菌過濾器而未采用高壓滅菌.但實(shí)驗(yàn)中細(xì)葉杜香未發(fā)現(xiàn)有抑菌活性，這可能與提取物的有效成分有關(guān)，在以往的研究中細(xì)葉杜香揮發(fā)油成分具有抑菌活性[10]，本文中所用提取方法會導(dǎo)致?lián)]發(fā)物質(zhì)損失，所以檢測不到細(xì)葉杜香的抑菌活性，也進(jìn)一步證實(shí)，細(xì)葉杜香的抑菌活性成分存在于揮發(fā)油中.現(xiàn)在對于植物抑菌作用的報(bào)道較多，但是真正存在于這些植物體內(nèi)的抑菌活性物質(zhì)是什么？主要分布在植物哪些部位？還有待深入研究.

參考文獻(xiàn)：

[1]Geissman T A.Flavonoid compounds，tannins，lignins and related compounds. In:Florkin M and Stotz EH (eds).Pyrrole Pigments，Isoprenoid Compounds and Phenolic Plant Constituents[M]. New York:Elsevier Press，1963.

[2]Schultes R E.The kingdom of plants;The importance of herbaria，botanical gardens and exploration;Plants as chemical factories;The future of plants in medicine.In (Ed.W.A.R.Thomson)Medicines from the earth[M].New York:McGraw-Hill Book Co.，1978.

[3]Marjorie M.Plant Products as Antimicrobial Agents[J].Clin Microbiol Rev，1999，12(4):564-582.

[4]周繇.長白山野生有毒植物資源的研究[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(3):260-264.

[5]黃松，杜方麓.罌粟科白屈菜族的化學(xué)成分及植物化學(xué)分類依據(jù)的研究進(jìn)展[J].湖南中藥導(dǎo)報(bào)，2002，8(10):582-584.

[6]李明，杜強(qiáng)，王艷.四種藥用植物對植物病原真菌的抑制作用[J].中國生物防治，2008，24(增刊):81-84.

[7]宋瑞佳，侯偉倬，楊杰，等.白花曼陀羅和白屈菜水浸液殺菌效果研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(9):4941-4942.

[8]范海延，薛廣厚，呂春茂，等.白屈菜中白屈菜紅堿的提取及抑菌活性[J].食品科學(xué)，2009，30(24):129.

[9]聞平，陳蕾，俞曉麗，等.胡桃楸提取物抗白念珠菌作用的機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24(1):51-53.

[10]談華，劉慶華.細(xì)葉杜香揮發(fā)油抑菌和殺菌作用的研究[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(3):33-36.

[11]劉利本，平家奇，高海飛，等.蒲公英不同部位提取物體外抑菌作用的比較[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，.2010，32(1):65-68.

[12]王大海，姬志勤，魏少鵬，等.冬凌草中抑菌成分研究[J].農(nóng)藥，2010，49(6):410-412.