GJB2基因條件敲除小鼠耳蝸外毛細胞凋亡時程觀察△

張延平 張曉強 劉雅莉 黃瑋 孫玉蕊

1 中國人民解放軍第309醫(yī)院耳鼻咽喉科(北京 100091)； 2 河南省醫(yī)學情報研究所； 3 河南省衛(wèi)生廳

GJB2基因位于染色體13q12，編碼縫隙連接蛋白26(Connxin 26, Cx26)，是構成細胞間縫隙連接(gap junction)的重要組成部分。Cx26在哺乳動物耳蝸中廣泛存在，它所構成的純合縫隙連接和雜合縫隙連接在維持耳蝸正常生理功能中起重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)該基因突變是導致人類非綜合征型聾(nonsyndromic sensorineural hearing impairment,NSHI)的主要原因之一。目前已經(jīng)報導的人類GJB2突變已經(jīng)超過120種，其中絕大多數(shù)為功能喪失性突變[1]。為了探討GJB2突變導致耳聾的機制，研究者先后報道了三種GJB2條件敲除小鼠的動物模型，即Cx26loxP/loxP OtogCre[2], Cx26loxP/ loxP Pax2-Cre和Cx26loxP/loxP foxg1-Cre小鼠[3]。上述三種動物都是耳蝸中特異性缺失Cx26表達，動物出生時內(nèi)耳發(fā)育正常，毛細胞在聽覺開始后不久出現(xiàn)死亡，聽覺發(fā)育成熟后出現(xiàn)耳聾，經(jīng)檢測，凋亡相關蛋白caspase 3在P17時的動物耳蝸細胞中表達陽性，提示凋亡可能是毛細胞死亡的主要原因[2]。上述研究主要關注整個耳蝸的細胞死亡情況，并沒有詳細探討外毛細胞的凋亡情況。因此本研究利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)鰲和的鬼筆環(huán)肽(phalloidin )和碘化丙啶(propidium iodide，PI)聯(lián)合染色技術，研究GJB2基因條件敲除小鼠聽覺發(fā)育成熟前后不同時期的基底膜毛細胞變化情況，為進一步研究凋亡在敲基因動物耳聾發(fā)病中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 GJB2基因條件敲除小鼠cCx26loxp/loxp-Pax2-Cre(cCx26ko)由轉基因小鼠Cx26loxp/loxp與 Cx26loxp/--Pax2-Cre小鼠(均由美國Emory大學林曦教授實驗室提供)雜交獲得，野生型BALB/c小鼠作為正常對照，動物統(tǒng)一編號，統(tǒng)一喂養(yǎng)，雙盲法測定，分別選取P8、P14、P18和P21四個發(fā)育階段各6只小鼠進行實驗，出生后第3天剪鼠尾提取基因組DNA確定基因型(方法及結果略)。

1.2 實驗試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS，Merk, 德國)、多聚甲醛(Merk, 德國)、Triton X-100(Sigma，美國)、FITC-conjugated phalloidin (Enzo, 法國)，PI(Sigma，美國)，F(xiàn)luoromount-GTM(SouthBiotech, 美國)，解剖顯微鏡(Olympus，日本)、激光共聚焦顯微鏡(LSM 510，Zeiss, Jena,德國) 等。

1.3 耳蝸基底膜鋪片 動物用戊巴比妥腹腔注射麻醉后，斷頭取耳蝸，在解剖顯微鏡下，用分離針將蝸尖挑開一小孔，挑破圓窗膜，取出鐙骨，用細玻璃吸管將4%多聚甲醛由蝸尖小孔灌注，使固定液經(jīng)前庭階、鼓階從前庭窗和圓窗流出，然后將標本放入該固定液里4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜。10% EDTA充分脫鈣，在冰PBS中將骨迷路去除，解剖出耳蝸基底膜，分為底、中、頂三段，進行后續(xù)染色。

1.4 FITC- phalloidin 和PI染色 耳蝸基底膜經(jīng)0.25% Triton X-100漂洗5 min， 浸泡于新鮮配置的 FITC- phalloidin 染液中染色30 min ，標記靜纖毛和毛細胞表皮板，經(jīng)PBS漂洗3次后，再用PI (10 μg/ml) 復染 10 min，標記細胞核，再次用PBS漂洗后，抗熒光衰減封片劑 Fluoromount-GTM封片。熒光顯微鏡下觀察毛細胞的變化，激光共聚焦顯微鏡拍照，每個時間點重復3次。

2 結果

2.1 野生型BALB/c小鼠耳蝸染色結果 熒光顯微鏡下可見，野生型BALB/c小鼠耳蝸出生后各階段被綠色異硫氰酸熒光素標記的鬼筆環(huán)肽染色的毛細胞肌動蛋白主要分布在毛細胞的纖毛和表皮板。外毛細胞排列整齊，纖毛呈V型排列,表皮板完好,結構正常。被PI染色的毛細胞核大小一致，染色均勻，外形規(guī)則，排列有序，無細胞核缺失(圖1b)。

2.2 cCx26小鼠耳蝸基底膜染色結果 熒光顯微鏡下，P8時cCx26小鼠耳蝸形態(tài)與相應時期野生型BALB/c小鼠耳蝸形態(tài)無明顯差異(圖1a1)。P14時cCx26小鼠表皮板開始稀松，外毛細胞(outer hair cells, OHC)核排列開始出現(xiàn)不規(guī)則，有些細胞有核染色加深現(xiàn)象，但尚未出現(xiàn)明顯的表皮板缺損和核形態(tài)異常(圖1a2 )。在P18時，耳蝸的表面形態(tài)在熒光顯微鏡下出現(xiàn)明顯的變化，OHC 核出現(xiàn)固縮、染色濃集、體積變小、核碎裂成片斷化，甚至核缺失(圖2)。FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色的毛細胞可見散在性的纖毛結構模糊,表皮板塌陷，將肌動蛋白染色與毛細胞核染色同部位檢查,毛細胞核輕微固縮時其表皮板和纖毛結構及染色大致正常,僅在毛細胞核明顯固縮時出現(xiàn)表皮板變形和塌陷，提示此時外毛細胞周圍的支持細胞，如Dieter細胞，也開始出現(xiàn)了零星的破壞。上述變化在中回最為明顯(圖2b)，其次為底回(圖2c)，而頂回(圖2a)只是出現(xiàn)OHC的形態(tài)不規(guī)則，并沒有明顯的核的破壞或消失。在P21時，耳蝸表面結構出現(xiàn)了更為嚴重的破壞，整個耳蝸都出現(xiàn)了OHC的缺失，中回的破壞最為嚴重，甚至出現(xiàn)了基底膜的片斷化斷裂和缺失，提示OHC和支持細胞都出現(xiàn)了缺失 (圖1a3)。與野生型小鼠相比, cCx26ko小鼠各階段內(nèi)毛細胞纖毛染色不規(guī)則，深淺不一，細胞核未見明顯形態(tài)異常及缺失。

圖1 小鼠耳蝸基底膜染色結果(×400)

a1～3為cCx26ko小鼠不同階段基底膜染色結果，b1～3為野生型小鼠基底膜染色結果。P8時cCx26ko小鼠(a1，中回)與野生型小鼠(b1)相比未見明顯差異，P14時cCx26ko表皮板出現(xiàn)疏松、OHCs細胞核深染(a2，中回)，但尚無顯著細胞缺失。P21時cCx26ko基底膜出現(xiàn)了大范圍的缺失，細胞排列紊亂(a3)，而野生型小鼠耳蝸基底膜細胞排列連續(xù)、整齊(b3)

圖2 P18cCx26ko小鼠基底膜染色結果(×400)

耳蝸的表面形態(tài)在熒光顯微鏡下出現(xiàn)明顯的變化。OHCs 核出現(xiàn)固縮(五角星所示)、染色濃集、體積變小、核碎裂成片斷化(箭頭所示)，甚至核缺失(星號所示)。其中中回(b)較底回(c)和頂回(a)改變明顯

3 討論

全國耳聾分子流行病學調(diào)查顯示, 我國大多數(shù)重度以上感音神經(jīng)性聾患者僅由為數(shù)不多的幾個基因突變所致[4,5]，其中, 最常見的致聾基因是GJB2 基因, 高達21.01% 的耳聾患者攜帶該基因突變，GJB2 基因突變在雙耳極重度聾組檢出率最高，達到 24. 67%[6]。目前GJB2突變導致耳聾的確切機制還不完全清楚。本文通過觀察GJB2基因條件敲除小鼠出生后不同階段的耳蝸PI和鬼筆環(huán)肽染色結果，發(fā)現(xiàn)在P18時外毛細胞出現(xiàn)了典型的細胞凋亡改變，為進一步研究凋亡在GJB2基因突變導致耳聾的作用機理提供了依據(jù)。

基因敲除小鼠是研究基因突變致病機制的良好工具。目前已經(jīng)有三種GJB2條件敲除小鼠模型報道[2,3]，盡管制作動物模型所使用的技術方法不同，但對小鼠耳蝸形態(tài)和功能的影響卻很一致。三種敲基因動物出生時耳蝸形態(tài)與野生型大致相同，提示GJB2基因對于小鼠耳蝸的出生前發(fā)育不起重要作用。光學顯微鏡下觀察耳蝸的組織結構顯示[1]，cCx26ko成年小鼠耳蝸沒有明顯的膜迷路積水，血管紋細胞也沒有明顯的缺失，在聽覺開始后可見支持細胞和外毛細胞死亡，但內(nèi)毛細胞形態(tài)改變不明顯。由于Cre基因的啟動子不同，使上述三種小鼠GJB2基因敲除的時間不一致，導致制作的模型小鼠耳蝸在出生后發(fā)育中出現(xiàn)一些差異。研究顯示[2]Cx26loxP/loxP OtogCre小鼠從出生到P14耳蝸的形態(tài)與野生型均無明顯差異，從P14開始，Corti器細胞缺失從內(nèi)毛細胞的支持細胞開始，逐漸蔓延到外毛細胞的支持細胞，然后是外毛細胞以及其他細胞，但內(nèi)毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形態(tài)完整，短聲ABR測試小鼠反應閾提高約30 dB；此外在P17小鼠耳蝸中檢測到caspase 3表達陽性，提示凋亡可能是cCx26ko小鼠耳蝸細胞死亡的主要原因之一。但是在Cx26loxP/loxP；Pax2Cre小鼠，GJB2基因在耳蝸出生后的發(fā)育中似乎起到了決定性的作用，光鏡下觀察到從 P9開始，耳蝸的Corti隧道和Neul氏間隙都未形成，細胞的死亡起始于 Claudius 細胞，然后是外毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞，小鼠的聽力損失也較為嚴重，短聲ABR測試顯示幾乎所有的頻率反應閾均提高到70～90 dB SPL[3]?？梢姴煌咛r間敲除GJB2基因，均可導致小鼠耳聾和耳蝸細胞的缺失，但產(chǎn)生的形態(tài)學改變和細胞缺失的順序存在細微的差別。本研究對Cx26loxP/loxP；Pax2Cre小鼠耳蝸掃描電鏡觀察結果提示外毛細胞缺失發(fā)生在P14和P21之間，但cCx26ko小鼠耳蝸毛細胞發(fā)生缺失的確切時間還不完全清楚[7]。因此本研究著重觀察了外毛細胞缺失與凋亡的關系，同時探討了外毛細胞缺失的時間，希望為今后進一步研究細胞凋亡在GJB2基因突變致聾機制中的作用提供實驗依據(jù)。

PI是一種標記死亡細胞DNA的熒光染料,應用PI染色方法,可以對已經(jīng)死亡但還存在有細胞結構的凋亡和壞死毛細胞進行定量分析。在PI染色的動物耳蝸基底膜中，可以觀察到四種類型的毛細胞核，即正常、凋亡、壞死和缺失，毛細胞核固縮和深染色通常被認為是細胞凋亡的典型形態(tài)學特征。但因耳蝸基底膜其它種類的細胞核也可以被PI染色，故在熒光顯微鏡下觀察毛細胞核形態(tài)學變化時應注意與其它細胞核相區(qū)別。鬼筆環(huán)肽特異性標記耳蝸毛細胞靜纖毛和表皮板的纖絲狀肌動蛋白，缺失意味著毛細胞的死亡和溶解。異硫氰酸熒光素標記的鬼筆環(huán)肽與PI聯(lián)合染色可以發(fā)現(xiàn)早期凋亡的毛細胞及觀察凋亡不同時期細胞纖毛和表皮板與毛細胞核形態(tài)學變化的關系[8]。

本文利用FITC標記的鬼筆環(huán)肽和PI對野生型和敲基因小鼠耳蝸基底膜進行染色,系統(tǒng)研究了小鼠出生后不同發(fā)育時期耳蝸Corti器外毛細胞的缺失方式和缺失時程，結果提示cCx26ko小鼠耳蝸外毛細胞的缺失方式為凋亡，在P18時外毛細胞發(fā)生了典型的凋亡改變，耳蝸Corti器的細胞損害在P14時可能已經(jīng)開始。這一結果為進一步研究cCx26ko小鼠耳蝸細胞凋亡機制提供了基礎。

1 Hoang Dinh E, Ahmad S, Chang Q, et al. Diverse deafness mechanisms of connexin mutations revealed by studies using in vitro approaches and mouse models[J]. Brain Res,2009,1 277:52.

2 Cohen-Salmon M, Ott T, Michel V, et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death[J]. Curr Biol,2002,12:1 106.

3 Wang Y, Chang Q, Tang W, et al. Targeted connexin26 ablation arrests postnatal development of the organ of Corti[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,385:33.

4 于飛, 韓東一, 戴樸, 等. 1190 例非綜合征性耳聾患者GJB2 基因突變序列分析[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2007,87:2 814.

5 Dai P, You Y, Cui J, et al. GJB2 mutat ion spectrum in deaf population in a typical southeastern area o f China[J]. J Otol, 2006,1:94.

6 王國建, 袁永一, 李榮，等. 不同聽力學表型人群中常見耳聾基因突變檢出率的分析[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2011，25：445.

7 張延平,佟明望, 李麗娜,等.GJB2基因條件敲除小鼠耳蝸掃描電鏡觀察[J]. 山東大學學報(醫(yī)學版),2010,48:9.

8 楊衛(wèi)平，胡博華.耳蝸毛細胞凋亡早期的檢測方法[J].軍醫(yī)進修學院學報,2005,26:122.