NGB基因轉(zhuǎn)染拮抗慶大霉素耳毒性作用的實驗研究*

任毅 周琦# 唐安洲 譚頌華 方勤 謝利紅 尹時華

1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧 530021)

腦紅蛋白(neuroglobin ,NGB)由德國Burmester等[1]于2000年首次報道，是存在于人和小鼠腦內(nèi)的一種功能類似于肌紅蛋白的攜氧球蛋白,其具有高的氧親和力且能和氧可逆性結(jié)合。目前研究表明[2～4],NGB是一種分子量約為17 kD的單體,其結(jié)合氧的能力弱于肌紅蛋白,但是強(qiáng)于血紅蛋白。NGB的氧結(jié)合特性與脊椎動物肌紅蛋白類似,提示二者有類似的功能，即NGB也有貯氧、促進(jìn)氧向線粒體擴(kuò)散或直接介導(dǎo)氧向線粒體傳遞的功能。2005年，尹時華等[5]采用RT-PCR方法,從小鼠腦組織總RNA中擴(kuò)增出NGB基因的全序列cDNA,構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pEGFP-NGB，并通過GeneJamer介導(dǎo)NGB基因轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，觀察到培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中NGBmRNA和蛋白水平均有較高表達(dá),成功證明了NGB基因離體轉(zhuǎn)染的可行性，為NGB基因治療提供了理論依據(jù)。本實驗試圖從電生理學(xué)和形態(tài)學(xué)方面證明NGB基因轉(zhuǎn)染對慶大霉素致豚鼠耳毒性的保護(hù)作用，從而為今后臨床治療感音神經(jīng)性聾提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型的制備 實驗動物為耳廓反射正常、體重300～350克、排除了ABR反應(yīng)閾大于40 dB SPL的健康花色黑目豚鼠120只(廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)，雌雄不限。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組24只，Ⅰ組為空白對照組，不作任何處理，Ⅱ組為人工外淋巴液對照組(經(jīng)左耳注入人工外淋巴液)，Ⅲ組為人工外淋巴液實驗組(經(jīng)左耳注入人工外淋巴液后肌肉注射慶大霉素)，Ⅳ組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(經(jīng)左耳注入空質(zhì)粒pEGFP-C1后肌肉注射慶大霉素)，V組為NGB基因轉(zhuǎn)染組(經(jīng)左耳注入pEGFP-NGB后肌肉注射慶大霉素)。慶大霉素(天津藥業(yè)焦作有限公司)均采用后腿肌肉注射120 mg·kg-1·d-1， 給藥14天后停藥喂養(yǎng)14天進(jìn)行檢測。動物實驗期間每天稱重以調(diào)整藥量。

1.2 感受態(tài)細(xì)菌的制備和質(zhì)粒擴(kuò)增 TSS法制備感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化，挑取pEGFP質(zhì)粒(尹時華博士課題已構(gòu)建)單克隆至含50 μg/ L卡那霉素的10 mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃震搖220 r/min ,培養(yǎng)16～20 h ,按照質(zhì)粒小量抽提試劑盒(杭州博日科技有限公司)說明提取質(zhì)粒，紫外分光光度計測定OD值定量，電泳初步分析其純度和濃度，并進(jìn)行基因測序,無基因突變或缺失等。

1.3 陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒復(fù)合物的制備 將陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)20 μl加入60 μl人工外淋巴液(NaCl 137 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl22 mmol/L，NaH2PO4 1 mmol/L，glucose1 1 mmol/L，NaHCO312 mmol/L，MgCl21 mmol/L )中, 輕輕混勻,靜置5 min 后加入10 μl 質(zhì)粒pEGFP - NGB(1 μg/μl) ,充分混勻,室溫靜置20 min 后備用。同法制備陽離子脂質(zhì)體-空質(zhì)粒復(fù)合物。

1.4 聽性腦干反應(yīng)測試 各組動物分別于給藥前后進(jìn)行ABR測試。測試儀器為美國智能公司電生理測試儀(美國IHS公司Intelligent Hearing System Smart Ep 2.22)。豚鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(上海西唐科技公司)35～40 mg/kg腹腔注射麻醉后，置于屏蔽倉內(nèi)進(jìn)行測試。記錄儀器使用電生理測試儀,插入式耳機(jī)于豚鼠外耳道氣導(dǎo)給聲，短聲刺激，最大刺激輸出為135 dB SPL。刺激速率21.1 次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，掃描時間10 ms，疊加次數(shù)為512次。測試聲從135 dB SPL開始，以10或5 dB逐項遞減或遞增，以能引出明確的、可重復(fù)的波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為反應(yīng)閾。

1.5 耳蝸內(nèi)微量注射術(shù) 1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉動物,常規(guī)消毒鋪巾。左耳后下切口,于聽泡背側(cè)用探針找到聽泡骨質(zhì)薄弱點(一般距離外耳門內(nèi)下5 mm處)，用咬骨鉗于聽泡骨質(zhì)薄弱處鑿開直徑約1 cm小孔,手術(shù)解剖顯微鏡下暴露耳蝸底回,用細(xì)針在耳蝸底回近圓窗處鉆一直徑1 mm小孔,用微量注射器將10 μl陽離子脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物(V組)緩慢注入耳蝸鼓階內(nèi),縫合耳后切口，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組以同法分別注入人工外淋巴液或空質(zhì)粒pEGFP-C1，Ⅰ組則不作任何處理。

1.6 硝酸銀染色耳蝸基底膜鋪片 行ABR測試后，各組取9只動物，斷頭取出聽泡,暴露耳蝸,摘除聽小骨,挑破蝸尖、蝸窗, 用細(xì)玻璃管將0.5%硝酸銀溶液從蝸尖至蝸底灌洗數(shù)次，然后將2.5%戊二醛固定液從蝸尖至蝸底灌洗一至兩次，置于4 ℃冰箱中后固定4～6小時。解剖顯微鏡下行耳蝸基底膜鋪片，病理圖像分析儀下觀察。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 各組取9只動物，4%多聚甲醛活體灌注動物,斷頭取出聽泡,暴露耳蝸,摘除聽小骨,挑破蝸尖、蝸窗,用細(xì)玻璃管將4%多聚甲醛從蝸尖至蝸底灌洗數(shù)次，置于4 ℃冰箱中后固定4～6小時。耳蝸標(biāo)本行10% EDTA脫鈣,組織石蠟包埋備用，石蠟切片,片厚4 μm，切片脫蠟。切片在3% H2O2中37 ℃孵育20 min,PBS漂洗，將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù)10 min后PBS漂洗，封閉,室溫孵育20 min。按1∶200比例滴加稀釋的Ⅰ抗NGB多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)， 4 ℃過夜。PBS漂洗，滴加Ⅱ抗工作液兔抗羊IgG抗體(福州 Maixin-Bio公司),37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，滴加SABC,37 ℃孵育20 min。PBS漂洗，顯色劑DAB(武漢Boster公司)顯色。沖洗，蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片。用Olympus CX41顯微照像(×400)并進(jìn)行圖像分析,以細(xì)胞陽性染色(胞漿和胞核呈棕黃色)的灰度值比較抗原表達(dá)量，灰度值越低表示細(xì)胞陽性表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒電泳圖 提取質(zhì)粒DNA pEGFP-C1和pEGFP-NGB，稀釋50倍后紫外分光光度計定量，OD值均大于0.4，表明其濃度均大于1 μg/μl(DNA濃度=OD值A(chǔ)1×50×稀釋倍數(shù)×0.001)。通過1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測質(zhì)粒DNA的純度和濃度(圖1)，基因測序結(jié)果顯示與原有基因序列一致。

圖1 質(zhì)粒電泳圖重組質(zhì)粒pEGFP-NGB較空質(zhì)粒pEGFP-C1的分子量大；且二者分子量均大于4 000 bp

2.2 各組動物給藥前后ABR反應(yīng)閾比較 各組動物給藥前后ABR反應(yīng)閾見表1。給藥后人工外淋巴液實驗組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組ABR閾值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；給藥后NGB基因轉(zhuǎn)染組ABR閾值較空白對照組和人工外淋巴液對照組均顯著增大(P<0.05)，較人工外淋巴液實驗組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均顯著降低(P<0.05)；給藥后NGB基因轉(zhuǎn)染組動物手術(shù)耳較非手術(shù)耳ABR閾值降低(P<0.05)。

表1 各組動物給藥前后ABR閾值比較

注：*與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組給藥后比較，P<0.05；△與同組左耳給藥后比較，P<0.05

2.3 各組動物耳蝸基底膜鋪片結(jié)果比較 空白對照組和人工外淋巴液對照組動物耳蝸基底膜見一排內(nèi)毛細(xì)胞三排外毛細(xì)胞整齊排列，數(shù)量無缺失(圖2a、b)。給藥后人工外淋巴液實驗組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組動物耳蝸基底膜均見極少量的毛細(xì)胞殘存，甚至消失殆盡，殘存細(xì)胞輪廓和細(xì)胞板顯示毛細(xì)胞的損傷由底回至頂回逐漸加重(圖2c、d)。給藥后NGB基因轉(zhuǎn)染組動物耳蝸基底膜均見部分毛細(xì)胞缺失，且主要是外毛細(xì)胞(圖2e)。

2.4 各組動物耳蝸免疫組織化學(xué)染色檢測NGB蛋白表達(dá)量的比較 空白對照組(圖3a) 和給藥后人工外淋巴液對照組(圖3b)動物耳蝸基底膜毛細(xì)胞無明顯NGB蛋白表達(dá)。給藥后人工外淋巴液實驗組(圖3c) 和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(圖3d) 動物耳蝸均見極少量殘存的基底膜毛細(xì)胞，無明顯NGB蛋白的表達(dá)。給藥后NGB基因轉(zhuǎn)染組動物耳蝸殘存的基底膜毛細(xì)胞有一定量的NGB蛋白表達(dá)(圖3e)。各組動物給藥后耳蝸基底膜毛細(xì)胞NGB蛋白表達(dá)的灰度值比較見表2。

圖2 各組動物耳蝸基底膜鋪片(硝酸銀染色×400)

a 空白對照組動物左耳蝸基底膜毛細(xì)胞排列整齊，無缺失；b 給藥后人工外淋巴液對照組動物左耳蝸基底膜毛細(xì)胞排列整齊，無缺失；c 給藥后人工外淋巴液實驗組動物左耳蝸基底膜均見毛細(xì)胞大量缺失；d 給藥后空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組動物左耳蝸基底膜均見毛細(xì)胞極少量殘存，幾乎消失殆盡；e 給藥后NGB基因轉(zhuǎn)染組動物左耳蝸基底膜均見毛細(xì)胞少量缺失

圖3 各組動物耳蝸毛細(xì)胞NGB蛋白的表達(dá)(SP染色×400)

a 空白對照組動物左耳蝸基底膜毛細(xì)胞無陽性表達(dá)；b 給藥后人工外淋巴液對照組動物左耳蝸基底膜毛細(xì)胞無陽性表達(dá)；c 給藥后人工外淋巴液實驗組動物左耳蝸基底膜毛細(xì)胞破壞明顯，無陽性表達(dá)；d 給藥后空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組動物左耳蝸基底膜毛細(xì)胞破壞明顯，無陽性表達(dá);e 給藥后NGB基因轉(zhuǎn)染組動物左耳蝸殘存的基底膜毛細(xì)胞有一定量陽性表達(dá)(黑色長箭頭示外毛細(xì)胞，短箭頭示內(nèi)毛細(xì)胞)

表2 各組動物給藥后耳蝸基底膜毛細(xì)胞NGB蛋白表達(dá)量的灰度值比較

注：*與其余各組比較，灰度值降低，NGB蛋白的表達(dá)量顯著增多(P<0.05)，△與非手術(shù)耳比較，灰度值降低，NGB蛋白的表達(dá)量顯著增多(P<0.05)

3 討論

基因治療是將正常的外源基因?qū)肷矬w靶細(xì)胞內(nèi),通過外源基因的表達(dá)彌補(bǔ)體內(nèi)缺失或缺陷基因的生物功能,或抑制某些有害基因的表達(dá),達(dá)到治療疾病目的的一種方法。Izumikawa等[6]首次證實Atoh1基因轉(zhuǎn)染至成年耳聾哺乳動物的耳蝸后，Corti器可獲得廣泛的結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。近年也有實驗發(fā)現(xiàn)Atoh1基因轉(zhuǎn)染至氨基糖苷類耳中毒豚鼠的內(nèi)耳，可促使前庭及耳蝸的毛細(xì)胞再生和功能恢復(fù)[7，8]，以上實驗證明基因治療應(yīng)用于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)及功能恢復(fù)是可行的。選擇合適的載體系統(tǒng)是基因治療的關(guān)鍵之一，目前基因治療常用載體可分為兩大類：病毒載體和非病毒載體。陽離子脂質(zhì)體屬于非病毒載體，它通過離子的相互作用可以有效地將任何分子量大小的DNA緊密結(jié)合,轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞,而且不整合到宿主細(xì)胞基因組中,因此陽離子脂質(zhì)體安全可靠，它既不會誘發(fā)細(xì)胞突變,也沒有免疫原性,而且容易大量制備[9]。陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的效率一直是人們關(guān)注的焦點,Zhu等[10]的研究表明,陽性脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可以持續(xù)9周以上。目前,陽離子脂質(zhì)體載體的安全性及有效性已在體內(nèi)外實驗中得到證實,Hsiao等[11]的動物實驗表明,脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染可以抑制腫瘤的生長,明顯延長動物的生存期。

本研究結(jié)果顯示，單純?nèi)斯ね饬馨鸵鹤⑷腚嗍蠖伜笃渎牴δ芗靶螒B(tài)學(xué)不受影響；NGB基因轉(zhuǎn)染實驗組動物聽功能和形態(tài)學(xué)受損程度較人工外淋巴液實驗組和空質(zhì)粒對照組小。NGB基因轉(zhuǎn)染組動物手術(shù)耳耳蝸基底膜毛細(xì)胞NGB蛋白表達(dá)量較其它各組均有顯著增高，說明本實驗將NGB基因成功轉(zhuǎn)染至動物耳蝸基底膜毛細(xì)胞,可使NGB基因轉(zhuǎn)染組豚鼠在慶大霉素耳中毒后其ABR反應(yīng)閾增幅降低和毛細(xì)胞形態(tài)破壞的程度減輕。

氨基糖苷類抗生素對耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有破壞作用，引發(fā)不可逆的感音神經(jīng)性聽力損失,已在大量的基礎(chǔ)實驗中得以充分證實。有學(xué)者提出其機(jī)制[12]是由氨基糖苷類抗生素?fù)p傷內(nèi)耳細(xì)胞線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP下降、離子濃度失衡，從而影響細(xì)胞換能所致。研究發(fā)現(xiàn)[13]，NGB作為攜氧球蛋白，能夠增強(qiáng)細(xì)胞將氧擴(kuò)散進(jìn)入線粒體的能力，提高氧利用率，滿足細(xì)胞活躍的需氧代謝需求。本實驗將陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)NGB基因轉(zhuǎn)染技術(shù)應(yīng)用于氨基糖苷類藥物損傷的豚鼠耳蝸，從本文結(jié)果看，對耳蝸的形態(tài)及功能起到了一定保護(hù)作用，其原因可能為：當(dāng)氨基糖苷類抗生素?fù)p傷內(nèi)耳細(xì)胞線粒體功能時，擴(kuò)散至線粒體的氧減少，阻礙細(xì)胞代謝活動，而將NGB基因轉(zhuǎn)染至內(nèi)耳后，可提高受損的線粒體內(nèi)氧含量，進(jìn)而改善細(xì)胞代謝活動中的缺氧情況，減輕氨基糖苷類抗生素造成的內(nèi)耳損傷。對于NGB基因轉(zhuǎn)染拮抗慶大霉素耳毒性的具體機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

1 Burmester T, Weich B, Reinhardt S, et al. A vertebrate globin expressed in the brain[J]. Nature，2000 ,407:520.

2 Garry DJ, Mammen PP. Neuroprotection and the role of neuroglobin[J]. Lancet , 2003 ,362:342.

3 Wystub S, Laufs T, Schmidt M, et al. Localization of neuroglobin protein in the mouse brain[J].Neurosci Lett , 2003 ,346:114.

4 Pesce A, Bolognesi M, Bocedi A, et al. Neuroglobin and cytoglobin. Fresh blood for the vertebrate globin family[J]. EMBO Rep, 2002 , 3:1 146.

5 尹時華,龔樹生,鄢開勝,等.重組小鼠質(zhì)粒pEGFP-NGB的構(gòu)建和在培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的實驗研究[J].中國病理生理雜志，2005，21：1 388.

6 Izumikawa M, Minoda R, Kawamoto K, et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals[J]. Nat Med,2005, 11:271.

7 Staecker H, Praetorius M, Baker K, et al. Vestibular hair cell regeneration and restoration of balance function induced by math1 gene transfer[J]. Otol Neurotol,2007,28:223.

8 Ladrech S, Wang J, Simonneau L, et al. Macrophage contribution to the response of the rat organ of Corti to amikacin[J]. Neurosci Res,2007,85:1 970.

9 Wareing M, Mhatre AN, Pettis R, et al. Cationic liposome mediated transgene expression in the guinea pig cochlea[J]. Hear Res,1999,128:61.

10 Zhu N, Liggitt D, Liu Y, et al. Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice[J]. Science,1993,261:209.

11 Hsiao M, Tse V, Carmel J, et al . Stabilization of cationic liposome plasmid DNA complexes by polyamines and poly (ethylene glycol) phospholipid conjugates for efficient in vivo gene delivery[J].FEBS Lett,1997,400 :233.

12 李昱,王愛梅.氨基糖甙類抗生素耳毒性的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14:459.

13 Vallone B, Nienhaus K, Matthes A, et al. The structure of carbonmonoxy neuroglobin reveals a heme-sliding mechanism for control of ligand affinity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101:17 351.