美伐他汀發(fā)酵菌種篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化

胡一峰 曹一嵐 黃俊龍

（浙江震元制藥有限公司，浙江 紹興 312000）

膽固醇是甾醇類激素和膽汁酸的前體，對維持細(xì)胞膜的完整性和生物體的健康至關(guān)重要。然而，低密度脂蛋白（LDL）膽固醇含量過高時，可沉淀在動脈血管壁導(dǎo)致心血管病的發(fā)生，心血管病疾病是發(fā)達(dá)國家導(dǎo)致死亡的兩大疾病之一。人體有兩種膽固醇來源，一是膳食膽固醇在腸胃道經(jīng)?；鵆oA-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（ACAT）酯化生成，二是由?；鵆oA經(jīng)甲基戊酸途徑在肝中合成。肝中生物合成的膽固醇約占總膽固醇的60％～70％，所以它是降脂治療的首選目標(biāo)。他汀類藥物是20世紀(jì)80年代后期國外上市的調(diào)血脂治療藥，是調(diào)節(jié)高膽固醇血癥、降低低密度脂蛋白、降低甘油三酯、提升高密度脂蛋白最有效的藥物［1-4］。從1987年首次面市以來，其市場銷售保持強勁增長勢頭。90年代以來，他汀類藥物的年銷售額都以20％的年平均增長率高速增長。90年代中期以后，每年都有三種他汀類藥物進(jìn)入世界十大最暢銷的治療心血管藥物行列。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球開發(fā)的他汀類藥物已有12個品種，在我國市場上已有8個品種，分別是阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他?。?-5］。

美伐他汀是桔青霉在發(fā)酵過程中的一種代謝產(chǎn)物，存在于菌絲中，屬HMG-CoA還原酶抑制劑，其作用是競爭性抑制HMG-CoA還原酶，該酶是膽固醇生物合成的限速酶，對哺乳動物和動物培養(yǎng)細(xì)胞的甾醇生物合成都有明顯的抑制作用［6］。美伐他汀于1976年由Akira Endo從真菌Penicillium Citrinum發(fā)現(xiàn)，并于1976年由A.G.Brown從Penicillium brvicompactum中單獨分離出來，其分子式為C23H24O5，分子量為390.52。作為第1個被發(fā)現(xiàn)的他汀類藥物，美伐他汀在該類藥物的研究開發(fā)上占有極其重要的地位。對美伐他汀產(chǎn)生菌的研究可以有效地提高美伐他汀的產(chǎn)量。我們對本公司保藏的美伐他汀生產(chǎn)菌進(jìn)行了系統(tǒng)地篩選和誘變，獲得了傳代穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，并對該菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

出發(fā)菌株桔青霉NS-3-16，為本公司所收集和保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1.0，黃豆粉1.0，硝酸鈉0.2，硫酸鎂0.1，葡萄糖4.0，瓊脂2.0，pH 6.0，121℃蒸汽滅菌30min；

搖瓶培養(yǎng)基：蛋白胨1.0，黃豆粉2.0，硝酸鈉0.2，硫酸鎂0.1，蔗糖10，pH 6.0，121℃蒸汽滅菌30min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1.0，黃豆粉2.5，硝酸鈉0.2，硫酸鎂0.1，蔗糖20，泡敵0.1，pH 6.0，121℃蒸汽滅菌30min；

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 斜面培養(yǎng)條件

24±1℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)箱9～11d。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件

轉(zhuǎn)速230～250r/min的搖床上培養(yǎng)，24±1℃培養(yǎng)3～4d。

1.3.3 50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件

裝量（消后體積）：20L；接種量：1L（5％）；培養(yǎng)溫度：24±1℃；通風(fēng)量：1：1～1.2；罐壓：50kPa；轉(zhuǎn)速：100～300r/min，若溶氧低于40％，則小幅度提高轉(zhuǎn)速，并注意泡沫情況；發(fā)酵前期注意泡沫情況，及時滴加泡敵，防止逃液。

1.4 篩選方法

取出發(fā)菌株冷凍管，置室溫融化，在無菌條件下，取0.1mL冷凍菌液至斜面，涂布均勻。于24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～11d，即得母斜面種子。

在母斜面中加入5mL生理鹽水，將菌絲體洗下，攪勻，取0.1mL菌懸液至子斜面，涂布均勻。于24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～11d，即得子斜面種子。

在子斜面中加入5mL無菌蒸餾水，將菌絲體洗下，震蕩均勻，并逐步稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。

（1）自然篩選

每個稀釋度涂6～10塊平板（￠9cm，加30mL培養(yǎng)基/只），每塊平板加0.1mL菌懸液，涂布均勻后貼上菌種標(biāo)簽，于24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～11d。

24±1℃培養(yǎng)9～11d后，典型的單菌落具有以下特征：

直徑：1～5mm

形狀：菌落豐滿，有較多皺凸，黃色。

用無菌接種環(huán)挑取符合要求的單菌落接種到已配制好的空白斜面培養(yǎng)基上，用"之"型均勻涂布，蓋緊塞子，用一層紗布包扎，并貼上菌種標(biāo)簽，于24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～11d。

斜面種子質(zhì)量要求：斜面菌層豐滿，有較多皺凸，黃色，無雜菌。

每支斜面種子做搖瓶考察，生產(chǎn)能力高的埋冷凍管，再做復(fù)篩。

（2）紫外篩選

取各稀釋度菌懸液4mL置于培養(yǎng)皿，無菌條件下以紫外燈30cm距離照射30s，照射后的菌懸液涂篩選平板，24±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9～11d后，挑選單菌落進(jìn)行篩選。

1.5 分析方法

1.5.1 菌濃測定：

取10mL發(fā)酵液離心，4000r/min，15～30min測上清液體積V，計算公式如下：菌濃（％）=（10-V）/10×100％。

1.5.2 總糖測定（DNS法）

（1）水解：取1mL發(fā)酵上清液，加入0.2mL 6mol/L的HCl，沸水浴5min，將發(fā)酵液中的糖分充分水解成還原糖；

（2）中和：取5mol/L NaOH逐滴加入，用中性pH試紙檢測，顯示中性偏堿即可。

（3）定容：粗略估計發(fā)酵液含糖量，用蒸餾水稀釋成相應(yīng)倍數(shù)，待測；

（4）還原糖測定：取帶測樣液1mL（含糖3～4mg），分別置于25mL容量瓶中，各加入DNS試劑2mL，置于沸水浴中煮兩分鐘進(jìn)行顯色，然后以流水迅速冷卻，用水定容到25mL，搖勻；以空白調(diào)零，在540nm處測定吸光度，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總糖含量。

1.5.3 美伐他汀測定

1.5.3.1 萃取

方法1：發(fā)酵液攪拌均勻，取5mL于250mL三角瓶中，加入20mL甲醇，密封瓶口，震搖15min，靜置5min。

方法2：發(fā)酵液攪拌均勻，取10mL于250mL三角瓶中，加入40mL醋酸乙酯，密封瓶口，磁力攪拌2h。

1.5.3.2 稀釋定容

取上清液1mL，用乙腈定容到10mL容量瓶；如有渾濁，HPLC進(jìn)樣前用膜過濾。

1.5.3.3 HPLC測含量

色譜柱：C18，5u（4.6×250mm）

流動相：CAN：0.1％磷酸（70：30）

檢測器：UV237nm

流速：1.0mL/min

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取美伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品，加乙腈溶解，濃度0.1mg/mL左右。

2 結(jié)果與討論

2.1 美伐他汀生產(chǎn)菌的選育

以桔青霉NS-3-16為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變及平板篩選后，共得121株變異菌株，經(jīng)搖瓶篩選、復(fù)篩，共得27株高產(chǎn)菌株，其中9株MV產(chǎn)量9g/L以上，與出發(fā)菌株的對照見表1。

表1 復(fù)篩后斜面種子搖瓶考察結(jié)果

選出NS-7-04作為進(jìn)一步研究的試驗菌，NS-7-04菌株的選育譜系圖見圖1。

圖1 NS-7-04菌株的選育譜系圖

2.2 50L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗

在50L自控發(fā)酵罐上對NS-7-04菌株發(fā)酵過程進(jìn)行了初步觀察，結(jié)果如表2和圖2～圖4。

表2 50L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗

圖2 第一批50L發(fā)酵罐發(fā)酵全過程

圖3 第二批50L發(fā)酵罐發(fā)酵全過程

圖4 第三批50L發(fā)酵罐發(fā)酵全過程

3 結(jié)論

（1）以桔青霉NS-3-16為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變及平板篩選后，經(jīng)搖瓶篩選、復(fù)篩，選育出高產(chǎn)菌株NS-7-04，與出發(fā)菌株NS-3-16相比較，其美伐他汀產(chǎn)率提高了52％。

（2）根據(jù)對培養(yǎng)條件的初步研究結(jié)果，得出較優(yōu)培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH 6.0，培養(yǎng)溫度24℃，每分鐘通風(fēng)量1：1（體積比），罐壓50kPa，發(fā)酵時間9～11d，發(fā)酵液中的美伐他汀含量最高可達(dá)9.25g/L。傳代試驗表明該菌株產(chǎn)美伐他汀能力和性狀較穩(wěn)定。

［1］張文琦，胡昌華.美伐他汀產(chǎn)生菌橘青霉原生質(zhì)體的制備與再生［J］.西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，31（5）：117-120.

［2］程文娟，楊大鵬，顧豐穎，等.微生物發(fā)酵產(chǎn)生他汀類化合物的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2011，（2）：76-80.

［3］郄麗萍，張玉蓮，陳麗華，等.美伐他汀產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體誘變育種［J］.河北化工，2007，（4）：32-33.

［4］吳惠芳.他汀類藥物整裝待發(fā)［N］.醫(yī)藥經(jīng)濟報，2004-05-24（B2）.

［5］倪文昊.他汀類原料藥出口百花齊放［N］.醫(yī)藥經(jīng)濟報，2005-04-20（C4）.