離子色譜法同時(shí)測(cè)定胞外培養(yǎng)液中的有機(jī)酸與核苷酸

法蕓 楊海燕 朱新術(shù)

（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所公共實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101）

離子色譜法同時(shí)測(cè)定胞外培養(yǎng)液中的有機(jī)酸與核苷酸

法蕓 楊海燕 朱新術(shù)

（中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所公共實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101）

建立了一種利用陰離子交換色譜柱分離，抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定乳酸、丙酸、丙酮酸、蘋果酸、磷酸二羥丙酮、檸檬酸、異檸檬酸7種有機(jī)酸和單磷酸核苷酸（AMP）、雙磷酸核苷酸（ADP）、三磷酸核苷酸（ATP）3種核苷酸的方法。采用IonPac AS11－HC陰離子交換柱，KOH梯度洗脫，流速1.00mL／min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積25μL。方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%～4.69%，線性相關(guān)系數(shù)為0.9906～0.9996，加標(biāo)回收率為80.71%～94.02%，方法可用于嗜熱厭氧菌胞外培養(yǎng)液中有機(jī)酸和核苷酸的同時(shí)測(cè)定。

離子色譜；電導(dǎo)檢測(cè)器；梯度洗脫；有機(jī)酸；核苷酸

1 前言

有機(jī)酸和核苷酸是一類在細(xì)胞代謝上極為重要的物質(zhì)，它們幾乎參與細(xì)胞的所有生化過程。近年來細(xì)胞的新陳代謝和通量研究已被廣泛關(guān)注，通過分析細(xì)胞代謝物的某些成分，特別是重要代謝物成分的檢測(cè)，對(duì)準(zhǔn)確的闡明新陳代謝的途徑有著非常重要的意義［1］。

比色法、分光法、酶法、氣相色譜法、高效液相色譜法等都可用于有機(jī)酸的測(cè)定，但這些方法一般需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)分離或衍生化，且同時(shí)分離檢測(cè)的有機(jī)酸種類較少。離子色譜法因其分析速度快、靈敏度高、能實(shí)現(xiàn)多組分同時(shí)分離定量等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為分析有機(jī)酸的有效方法［2］。目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定核苷酸的方法，主要有離子交換液相色譜法和反相液相色譜法，多數(shù)利用紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定［3］。利用離子色譜法，電導(dǎo)檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定有機(jī)酸和核苷酸的報(bào)道很少。采用陰離子交換色譜和電導(dǎo)檢測(cè)法，建立了優(yōu)化的梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)7種有機(jī)酸和3種核苷酸的同時(shí)檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與材料

ICS 5000多功能色譜裝置（美國(guó)ThermoFisher公司），包括雙泵（DP）模塊、抑制電導(dǎo)檢測(cè)器／（DC）模塊、淋洗液自動(dòng)發(fā)生模塊（EG）、自動(dòng)進(jìn)樣器（AS）模塊；Milli－Q Advantage A10超純水制備儀。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：乳酸、丙酸、丙酮酸、蘋果酸、磷酸二羥丙酮、檸檬酸、異檸檬酸7種有機(jī)酸及單磷酸核苷酸（AMP）、雙磷酸核苷酸（ADP）、三磷酸核苷酸（ATP）均為色譜純（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）；

2.2 樣品制備

取1mL發(fā)酵液置于2mL塑料離心管中，以6 000r／min速度離心5min，固體沉淀于離心管底。取適量上清液，用水稀釋100倍，稀釋液過IC－RP柱除去蛋白、色素等有機(jī)雜質(zhì)。經(jīng)0.23μm濾膜過濾除去微米級(jí)懸浮物。

IC－RP柱（1.0mL，Agela Technologies）使用前須先經(jīng)5mL甲醇、10mL水活化，放置20min后使用。當(dāng)樣品溶液通過該柱時(shí)，前面3mL棄去，后面溶液待檢測(cè)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配制乳酸、丙酸、丙酮酸、蘋果酸、磷酸二羥丙酮、檸檬酸、異檸檬酸、AMP、ADP、ATP質(zhì)量濃度均為1g／L的儲(chǔ)備液，然后用其配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、3.0、6.0、12.0、25.0、50.0mg／L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按不同濃度分別進(jìn)樣，以峰面積－濃度繪制各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 色譜條件

IonPac AS11－HC陰離子交換柱，包括分析柱（250mm×4mm）和保護(hù)柱（50mm×4mm）。采用KOH梯度淋洗，流速1.00mL／min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積25μL。梯度淋洗程序如表1所示。

表1 梯度淋洗程序Table 1 Gradient elution program

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

選用親水性較強(qiáng)、IonPac AS11－HC陰離子交換柱，可以減少疏水性離子在樹脂上的吸附，縮短這些組分的保留時(shí)間并改善峰形。高的柱容量有利于復(fù)雜樣品中濃度差別較大組分的分析。以KOH為淋洗液，能同時(shí)分離與樹脂結(jié)合力不同的陰離子，并且抑制產(chǎn)物是水，本底電導(dǎo)比較低。由于ADP特殊的分子結(jié)構(gòu)，它的兩個(gè)磷酸基團(tuán)都可以和樹脂發(fā)生作用，與樹脂的結(jié)合力最強(qiáng)，核苷酸ADP與固定相的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小分子有機(jī)酸根離子和其他核苷酸，最不易洗脫。為使10種組分在一定的時(shí)間內(nèi)完全洗脫，故采用梯度淋洗方法。以2.4節(jié)所述的梯度淋洗程序進(jìn)行洗脫，10種待測(cè)組分一次進(jìn)樣可以得到很好的分離并保證峰形和分辨率，各種組分的出峰時(shí)間小于35min。圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

3.2 干擾試驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)液的成分復(fù)雜，為驗(yàn)證在選擇的色譜條件下是否能很好地將目標(biāo)離子與其他離子分離，配制含有氯離子、硝酸根離子、硫酸根離子的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.4節(jié)條件下直接進(jìn)樣測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述常見陰離子對(duì)待測(cè)組分的出峰無干擾。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Figure 1.A chromatogram of the mixed standard solution.

3.3 重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和加標(biāo)回收率

用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、3.0、6.0、12.0、25.0、50.0mg／L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次進(jìn)樣，以峰面積Y為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度X（mg／L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。選擇濃度分別為6.0mg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣8次，測(cè)得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%～4.69%。選擇一個(gè)熱纖梭菌胞外培養(yǎng)液進(jìn)行加標(biāo)水平的回收率測(cè)定。上述實(shí)驗(yàn)所得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、回收率如表2所示。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明7種有機(jī)酸和3種核苷酸都具有良好的線性關(guān)系。

表2 線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r），and relative standard deviations

3.4 樣品分析

將熱纖梭菌胞外培養(yǎng)液樣品按照2.2所述方法進(jìn)行前處理，在KOH梯度洗脫程序下，樣品中有機(jī)酸和核苷酸得到了較好分離，峰形尖銳。得到的組分濃度分別為乳酸234.14mg／L、丙酸58.98mg／L、丙酮酸87.24mg／L、檸檬酸2 500.68mg／L、AMP 318.00mg／L、ADP 757.80mg／L、ATP 920.14mg／L。圖2為測(cè)定熱纖梭菌胞外培養(yǎng)液中有機(jī)酸和核苷酸的色譜圖。

圖2 熱纖梭菌胞內(nèi)提取物樣品的色譜圖Figure 2.A chromatogram of the clostridium thermocellum cell extract.

4 結(jié)語

陰離子交換色譜，電導(dǎo)檢測(cè)器可用于同時(shí)測(cè)定熱纖梭菌胞外培養(yǎng)液中的有機(jī)酸和核苷酸，方法簡(jiǎn)單易行，靈敏度、重現(xiàn)性和相關(guān)性好，為發(fā)酵工藝過程中技術(shù)監(jiān)控和質(zhì)量控制提供了有效的分析方法。

［1］Loret MO，Pedersen L，F(xiàn)rancois J.Revised procedures for yeast metabolites extraction：application to a glucose pulse to carbon－limited yeast cultures，which reveals a transient activation of the purine salvage pathway［J］.Yeast，2007，24（1）：47－60.

［2］錢兵，章燕，李莎，等.反相高效液相色譜法測(cè)定丙酸發(fā)酵液中的有機(jī)酸［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2007，35（11）：1651－1653.

［3］李意.離子交換色譜法測(cè)定小球藻提取物中的核苷酸［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2004，32（8）：1077－1079.

Simultaneous Determination of Organic Acids and Nucleotides in Extracellular Media by Ion Chromatography

FA Yun，YANG Haiyan，ZHU Xinshu

（PublicLaboratory，QingdaoInstituteofBiomassEnergyandBioprocessTechnology，ChineseAcademyofScience，Qingdao，Shandong266101，China）

A new method using ion－chromatography with anion exchange column and suppressed conductivity detection was established to simultaneously determining seven organic acids including lactic acid，propionic acid，pyruvic acid，malic acid，dihydroxyacetone phosphate，citric acid，isocitric acid，and three kinds of nucleotides including AMP，ADP，and ATP.The separation was performed on an IonPac AS11－HC column with KOH solution as the mobile phase at a flow rate of 1.00mL／min and at 30℃of column temperature and with the injection volume of 25μL.The relative standard derivation and the correlation coefficient was 0.39%～4.69%and 0.9906～0.9996，respectively.The recovery ranged from 80.71%to 94.02%.The method has been applied to simultaneously determine organic acids and nucleotides in thermoanaerobacter extracellular media with satisfactory results.

ion－chromatography；the suppressed conductivity detector；gradient elution；organic acid；nucleotides

法蕓，女，高級(jí)工程師，主要從事色譜分析。E－mail：fayun＠qibebt.ac.cn

O657.7＋5；TH833

A

2095－1035（2012）03－0066－03

10.3969／j.issn.2095－1035.2012.03.021

2012－07－03

2012－08－06

中科院儀器設(shè)備升級(jí)改造項(xiàng)目（yg2010072）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助（2011SJGZ06）。