氣體發(fā)泡PLA/PS共混高聚物制備組織工程支架研究

周長(zhǎng)春,馬 梁,董志紅

(1.四川大學(xué)國家生物醫(yī)學(xué)工程研究中心,四川成都 610044; 2.華盛頓大學(xué)機(jī)械工程系,美國西雅圖 98195-2600; 3.成都大學(xué)工業(yè)制造學(xué)院,四川成都 610106)

0 引 言

傳統(tǒng)的硬組織修復(fù)生物材料一般由不銹鋼、鈦及其合金制成,由于人體骨骼的剛性與金屬材料的剛性相差很大,導(dǎo)致金屬植入體會(huì)阻礙骨折部位周圍骨痂的快速形成,從而破壞骨骼愈合過程中應(yīng)該承受的正常應(yīng)力環(huán)境,導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨萎縮,所以金屬類植入體材料一般需要通過二次手術(shù)取出,這給患者帶來了巨大的痛苦[6].由此,科研人員開始嘗試?yán)每山到馕盏纳锊牧蟻韺?duì)受損硬組織進(jìn)行修復(fù)重建,PLA正是其中的研究熱點(diǎn)之一[7-9].

作為可降解的硬組織修復(fù)材料,實(shí)體狀態(tài)的PLA材料是不具有骨傳導(dǎo)性的,唯有多孔的支架材料結(jié)構(gòu)才有利于組織細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、增殖,并利于細(xì)胞養(yǎng)料的輸送和廢棄物的排泄,而制備可控制的三維多孔結(jié)構(gòu)成為制備骨組織支架材料的關(guān)鍵[10].

本研究采用氣體物理發(fā)泡工藝,對(duì)不可共混的雙相高聚物PLA和聚苯乙烯(Polystyrene,PS)材料進(jìn)行多孔支架微觀結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)制備研究.由于經(jīng)氣體物理發(fā)泡的單相高聚物泡沫孔隙大多為閉孔結(jié)構(gòu),而組織工程支架材料設(shè)計(jì)要求必須為三維聯(lián)通貫通孔結(jié)構(gòu),因此,本研究引入新相聚苯乙烯,以期在材料發(fā)泡以后經(jīng)溶蝕工藝處理最終形成三維可控的多孔結(jié)構(gòu),通過發(fā)泡工藝控制泡沫材料的空隙結(jié)構(gòu)和大小,從而制備具有高空隙率、聯(lián)通孔徑結(jié)構(gòu)、孔徑大小可控、可生物降解的三維多孔生物支架材料.同時(shí),本研究還在制備的多孔支架上進(jìn)行了成骨細(xì)胞的種植實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,成骨細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)良好,增殖、分化效果明顯,經(jīng)過3周細(xì)胞種植,初步形成了三維立體的細(xì)胞團(tuán)聚生長(zhǎng)結(jié)構(gòu),成骨細(xì)胞在支架孔隙中的延伸,傳遞性良好.

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括:PLA來自于Natureworks LLC(Extrusion grade,4032D),PS來自于Dow Chemical;PLA和PS以50∶50的比重率共混并注塑擠壓成形,試樣呈乳白色,厚度為0.5～0.7 mm,密度為1.162 g/cm3;發(fā)泡劑氣體來自于Airgas Nor Pac,Inc.的醫(yī)學(xué)級(jí)CO2(99.95%純度);溶解工藝中用到的有機(jī)溶劑Cyclohexane(C6H12assay by GC,corrected for water> 99.0%)與Dichloroethane(C2H4Cl2assay by GC,corrected for water>99.0%)來自于Mallinckrodt Baker, Inc.;人成骨細(xì)胞(Human osteoblast cells,cell line Hfob1.19)來自于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(American Type Culture Collection,ATCC);細(xì)胞培養(yǎng)液為容積比50%的Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)與50%Ham’s F12的混合液,Ham’s F12混合液中同時(shí)包含了10%的胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS).

1.2 方 法

在實(shí)驗(yàn)中,PLA/PS共混材料采用氣體物理發(fā)泡工藝發(fā)泡.為了優(yōu)化發(fā)泡工藝,以確定合適的氣體吸附條件并為后續(xù)制備可控孔徑的發(fā)泡材料作準(zhǔn)備,本研究對(duì)2組不同條件的吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究:吸附二氧化碳?xì)怏w壓力分別為2、5 MPa,發(fā)泡溫度介于100℃～145℃區(qū)間調(diào)整,發(fā)泡時(shí)間選擇為25 s、30 s、45 s,每組參數(shù)至少重復(fù)5個(gè)試樣.在溶解工藝中,利用Cyclohexane與Dichloroethane試劑對(duì) PLA、PS、PLA/PS共混材料、PLA/PS發(fā)泡材料等分別進(jìn)行了溶解實(shí)驗(yàn)研究,將試樣材料浸沒在溶液中持續(xù)進(jìn)行24 h到一周的溶解測(cè)試,期間按時(shí)間段取出試樣,清洗、干燥、稱量,以確定合適的溶劑.

2 多孔支架材料表征

制備好的發(fā)泡材料首先應(yīng)對(duì)其材料特性進(jìn)行測(cè)定,如材料相對(duì)密度測(cè)定,SEM微觀結(jié)構(gòu)觀察,材料孔徑大小測(cè)定以及空隙率測(cè)定等.本研究所用的電子掃描電鏡設(shè)備為FEI Siron X L 30 EDAX EDS,用來觀察未發(fā)泡材料及發(fā)泡后材料的微觀結(jié)構(gòu).在SEM實(shí)驗(yàn)中,試樣樣品通過浸沒在液氮中冷卻脆化后,從樣品中間折斷,并在試樣斷口處噴鍍上一層薄金膜.從SEM獲取的樣品圖像經(jīng)Image J圖像處理軟件來分析材料的孔徑尺寸大小及分布.發(fā)泡后材料的孔隙率可以由以下公式計(jì)算,

式中,ε為試樣的孔隙率;ρf及ρs分別為材料發(fā)泡后的密度與未發(fā)泡前的密度.發(fā)泡材料的密度可由阿基米德排水法測(cè)得,具體執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)ASTM D-792 standard測(cè)定,其計(jì)算公式為,

式中,ρ為試樣密度,wa為樣品在空氣中測(cè)得的重量,wb為樣品浸沒在蒸餾水中所測(cè)得的重量,ρw為所用蒸餾水的密度,該值在室溫下為0.9975 g/cm3.

目前我國對(duì)PBL教學(xué)效果的評(píng)價(jià)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大多選擇主觀評(píng)價(jià)或主觀評(píng)價(jià)法與考核法相結(jié)合方式，大致從以下幾方面進(jìn)行評(píng)價(jià)：

3 成骨細(xì)胞種植

未發(fā)泡及發(fā)泡過后的PLA/PS共混試樣在經(jīng)過溶蝕處理后都被用于種植培育細(xì)胞.種植細(xì)胞前,所有試樣均用清水漂洗多次,再用70%的乙醛浸泡30 min消毒,然后用紫外光照30 min殺菌.滅菌后的試樣先浸泡在細(xì)胞培育液中3 d,預(yù)培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞首先被培育在含有DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培育環(huán)境為34℃以及5%CO2.預(yù)培養(yǎng)完成后,該細(xì)胞用0.25%的胰島素經(jīng)轉(zhuǎn)速為1 000 rpm的離心機(jī)離心5 min從培養(yǎng)液中分離出來,去除頂層液體,將分離出來的細(xì)胞置于干凈的皮氏培養(yǎng)皿中.然后,細(xì)胞以大約5×105個(gè)/mL的密度直接種植在準(zhǔn)備好的試樣中,1 d后細(xì)胞附著在試樣上,其后,再往試樣上添加2 mL的培養(yǎng)液,之后將試樣放置在34℃,5%CO2的環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培育.

同時(shí),為了更好地觀察試樣內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況,本研究將細(xì)胞進(jìn)行了染色處理.實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞采用Live/dead viability/cytotoxicity kit(Invitrogen)染色,該物質(zhì)包含2種熒光染料:Calcein AM與 EthD-1.其中,Calcein AM可以很好地在活細(xì)胞中保留并顯示出較強(qiáng)的綠色熒光(顯示波長(zhǎng)范圍:ex/em 495 nm/ 515 nm),而EthD-1則通過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部與核酸結(jié)合產(chǎn)生紅色的熒光.EthD-1只能對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色.這樣,活(死)細(xì)胞便可以通過此染色物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分.最后,用熒光顯微鏡(LEICA M250 FA)觀察細(xì)胞繁殖情況.

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 發(fā)泡可控工藝參數(shù)對(duì)支架孔隙的影響

在氣體物理發(fā)泡工藝中,有2個(gè)因素將影響發(fā)泡材料的泡沫空隙及特性,即發(fā)泡時(shí)試樣所吸附的CO2氣體濃度及發(fā)泡能量.其中,發(fā)泡能量又由發(fā)泡過程中的發(fā)泡溫度和發(fā)泡時(shí)間所決定.對(duì)吸附同等氣體濃度的試樣來說,發(fā)泡工藝參數(shù)對(duì)發(fā)泡材料的泡沫孔徑有著直接影響,它們構(gòu)成了發(fā)泡工藝的可控工藝參數(shù).表1所示為本研究中采用的可控工藝參數(shù).

表1 實(shí)驗(yàn)采用的氣體物理發(fā)泡工藝參數(shù)

發(fā)泡工藝參數(shù)對(duì)發(fā)泡材料泡沫孔徑的影響如圖1所示.

圖1 發(fā)泡工藝參數(shù)對(duì)發(fā)泡材料泡沫孔徑的影響

從圖1可看出,在發(fā)泡溫度為100℃～125℃區(qū)間,發(fā)泡材料的泡沫孔徑尺寸呈遞增趨勢(shì),該值由20μm增加到70μm.當(dāng)發(fā)泡溫度超過125℃以后,發(fā)泡材料的泡沫孔徑尺寸則呈遞減趨勢(shì),孔徑由70 μm減小到50μm左右;比較不同的發(fā)泡時(shí)間可見,發(fā)泡時(shí)間為30 s的時(shí)候,得到的泡沫孔徑尺寸為最大,20 s時(shí)次之,45 s最小,并且這個(gè)現(xiàn)象對(duì)所有發(fā)泡溫度都呈一致規(guī)律變化.其原理是:在發(fā)泡過程中,材料內(nèi)部首先形成無數(shù)的泡沫初核,不同的發(fā)泡溫度意味著不同的發(fā)泡能量,它們將產(chǎn)生不同數(shù)量的泡沫初核,這些泡沫初核隨著發(fā)泡時(shí)間的延續(xù)逐漸長(zhǎng)大,在未達(dá)到發(fā)泡能量極值/臨界點(diǎn)之前(如在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)泡溫度為100℃～125℃區(qū)間),溶解吸附在聚合物矩陣中的CO2氣體由于發(fā)泡能量的驅(qū)使,不斷地從聚合物矩陣中擴(kuò)散到成形的泡沫氣核中,促使了泡沫的長(zhǎng)大,泡沫的尺寸孔徑呈現(xiàn)遞增趨勢(shì);但在超過發(fā)泡能量極值/臨界點(diǎn)之后,由于發(fā)泡能量過高,高溫致使聚合物材料軟化,無法繼續(xù)支撐過度膨脹的氣泡,因而一部分氣體將從破裂的材料表皮或側(cè)面逸出,從而導(dǎo)致泡沫壁破裂、坍塌,使得泡沫孔徑尺寸減小.

不同的氣體吸附壓力與濃度對(duì)材料的泡沫孔徑影響如圖2所示.

圖2中,圖2(a)的氣體吸附壓力為2 MPa,發(fā)泡時(shí)CO2的濃度為5.31%,其泡沫孔徑大小為10μm～20μm,圖2(b)的氣體吸附壓力為5 MPa,發(fā)泡時(shí)CO2的濃度為9.23%,其泡沫孔徑大小為20μm～40 μm.圖2中,亮白色的區(qū)域?yàn)镻LA材料相,暗黑色的區(qū)域?yàn)镻S相,鑲嵌于發(fā)泡后的PLA矩陣中,從圖2可看出,PLA相和PS相各自團(tuán)聚在一起,說明它們屬于2種互不相容的材料,這為后續(xù)PS相的去除提供了可能.

圖2 不同吸附氣體壓力與濃度對(duì)發(fā)泡材料泡沫孔徑的影響

4.2 PS相去除溶蝕工藝

材料發(fā)泡后,泡沫中同時(shí)包含著PLA相和PS相,由于PS相不是一種可降解的聚合物,且PLA材料和PS材料的溶解性能不一樣.故本研究選擇環(huán)己烷(Cyclohexane)溶劑將PS相溶蝕掉,僅保留PLA相及其所具有的多孔結(jié)構(gòu),從而提高材料的孔隙率,增強(qiáng)其聯(lián)通性能.

發(fā)泡后的試樣PS相經(jīng)溶蝕去除工藝處理后的掃描電鏡圖像如圖3所示.

圖3 試樣PS相溶蝕去除的掃描電鏡圖像

圖3中,圖3(a)為未經(jīng)溶解處理的PLA/PS共混試樣經(jīng)過發(fā)泡后的電子掃描電鏡圖像,經(jīng)過發(fā)泡工藝,材料矩陣中可見明顯的孔隙結(jié)構(gòu),暗黑色的PS相呈團(tuán)聚狀態(tài)鑲嵌于較亮的PLA矩陣之中,圖中可見一些明顯的孔隙通道,這些孔隙通道可為溶解處理提供便利以供溶液進(jìn)入材料內(nèi)部,圖示泡沫孔徑尺寸大小大約為10μm～30μm.圖3(b)為經(jīng)過發(fā)泡后的PLA/PS試樣在溶解過程中的掃描電鏡圖像,圖像顯示,經(jīng)過溶解處理,絕大部分的PS相已經(jīng)被溶解去除掉了,少許的PS(圖中圓圈中所示區(qū)域)附著在PLA的泡沫孔隙中處于正在被溶蝕之中.圖3 (c)、(d)為發(fā)泡后的PLA/PS試樣經(jīng)過7 d的溶蝕處理后,PS相完全被溶蝕掉后的電子掃描電鏡圖像,圖3(c)為沿X軸折斷的橫截面圖像,圖3(d)為沿Y軸折斷的橫截面圖像,試樣在這兩個(gè)方向上的結(jié)果大致相同,泡沫尺寸進(jìn)一步增大,孔隙率大為提高,且試樣在3維空間結(jié)構(gòu)下呈現(xiàn)出一種均勻、聯(lián)通的多孔中空泡沫結(jié)構(gòu),各個(gè)泡沫單元間彼此聯(lián)通.

4.3 細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)過不同培養(yǎng)時(shí)間段的生長(zhǎng)情況如圖4所示.

圖4 細(xì)胞在經(jīng)過不同培養(yǎng)時(shí)間段的生長(zhǎng)情況

圖4中,圖4(a)為細(xì)胞剛剛種植的情況,圖4 (b)為細(xì)胞經(jīng)過一周培養(yǎng)的情況,圖4(c)為細(xì)胞經(jīng)過兩周培養(yǎng)的情況.從圖4(a)可看出,細(xì)胞剛種植時(shí),在試樣內(nèi)部幾乎不能看見任何細(xì)胞,可見此時(shí)細(xì)胞尚為附著、擴(kuò)散至支架內(nèi)部.經(jīng)過一周時(shí)間的培養(yǎng)(見圖4(b)),細(xì)胞數(shù)量有了很大的增殖,且生長(zhǎng)情況良好.經(jīng)過2周左右的時(shí)間培養(yǎng)(見圖4(c),細(xì)胞得到了更大程度的增殖.初步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),增殖的細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間呈現(xiàn)出一種幾何數(shù)量級(jí)的增殖.支架材料的三維孔隙結(jié)構(gòu)為成骨細(xì)胞的繁殖提供了誘導(dǎo)性的組織結(jié)構(gòu),較高的孔隙率及相互聯(lián)通的孔隙為細(xì)胞的延展、細(xì)胞養(yǎng)料及廢棄物的輸送提供了通道,從而促進(jìn)了成骨細(xì)胞在支架孔隙結(jié)構(gòu)中的蔓延生長(zhǎng)和分化傳遞.

成骨細(xì)胞在二維及三維環(huán)境中的生長(zhǎng)情況如圖5所示.

圖5 成骨細(xì)胞在二維及三維環(huán)境中的生長(zhǎng)情況

圖5中,圖5(a)為成骨細(xì)胞在三維多孔PLA支架材料上的生長(zhǎng)情況,圖5(b)為成骨細(xì)胞在二維培養(yǎng)皿表面上的生長(zhǎng)情況.從圖5(a)可以看出,成骨細(xì)胞在三維的PLA多孔支架材料上,細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)情況很好,圖中熒光區(qū)域顯示為繁殖的活體細(xì)胞,它們呈球形或扁長(zhǎng)狀在試樣內(nèi)部構(gòu)建起了一種三維特征結(jié)構(gòu),并隨著PLA的多孔結(jié)構(gòu)在生物體內(nèi)被逐漸代謝掉,新生的細(xì)胞將占據(jù)其原有的空間.因此,這類可降解的多孔支架材料可用作骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)或是修復(fù)、替代生物材料.從圖5(b)可以看出,盡管在二維的玻璃表面細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)情況很好,但是其無法構(gòu)建類似于生物體內(nèi)的三維空間結(jié)構(gòu),新生細(xì)胞無法快速有效地形成空間結(jié)構(gòu)和組織,此表明實(shí)心狀態(tài)的材料不適宜用于做誘導(dǎo)性的組織工程材料.

5 結(jié) 論

利用氣體物理發(fā)泡工藝可以制備一類多孔組織工程支架材料,支架的空隙結(jié)構(gòu)可以通過調(diào)控發(fā)泡工藝中的可控參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì).氣體物理發(fā)泡過程中,氣體的吸附壓力、吸附時(shí)間,發(fā)泡過程中的發(fā)泡溫度、發(fā)泡時(shí)間將對(duì)材料的最終孔隙結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響.發(fā)泡后對(duì)材料進(jìn)行溶蝕工藝處理,可以有效去除掉鑲嵌的不可共混PS相,從而獲得具有聯(lián)通特性的孔隙結(jié)構(gòu).通過對(duì)該支架材料進(jìn)行成骨細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,細(xì)胞在支架內(nèi)生長(zhǎng)情況良好,經(jīng)過2周培養(yǎng),細(xì)胞初步表現(xiàn)出三維空間蔓延傳遞生長(zhǎng)的特征.對(duì)比二維以及三維成骨細(xì)胞種植結(jié)果發(fā)現(xiàn),盡管在二維的玻璃表面細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)情況很好,但其無法構(gòu)建類似于生物體內(nèi)的三維空間結(jié)構(gòu),新生細(xì)胞無法快速有效地形成空間結(jié)構(gòu)和組織,表明實(shí)心狀態(tài)的材料不適宜用做誘導(dǎo)性的組織工程材料.本研究表明,經(jīng)此方法制備的多孔支架材料有望進(jìn)一步研究開發(fā)而成為一種優(yōu)良的用于組織工程修復(fù)的生物材料.但需要說明的是,許多研究工作,包括材料的力學(xué)性能表征、生物特性評(píng)估以及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等,還有待進(jìn)一步深入.

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