利用5-氨基乙酰丙酸脫水酶缺失的重組大腸桿菌合成5-氨基乙酰丙酸

郭小飛，陳久洲，張莉露，賈士儒，鄭 平

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

利用5-氨基乙酰丙酸脫水酶缺失的重組大腸桿菌合成5-氨基乙酰丙酸

郭小飛1,2,3，陳久洲2,3，張莉露2,3，賈士儒1，鄭 平2,3

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

生物法合成 5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)大多通過添加 5-ALA脫水酶(ALAD)的抑制劑乙酰丙酸(LA)減少 5-ALA的降解，造成生產(chǎn)成本增高，發(fā)酵工藝復(fù)雜.本文利用ALAD缺失的大腸桿菌ZSEc2作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變的方法，獲得可利用外源血紅素恢復(fù)正常生長(zhǎng)的大腸桿菌突變株 ZGEc1，并過表達(dá)來自沼澤紅假單胞菌的 5-ALA合成酶(ALAS)基因，最終建立一條不需要添加ALAD抑制劑的5-ALA的生物合成新路線.經(jīng)過培養(yǎng)基初步優(yōu)化，重組菌可在胞外積累約1,g/L的5-ALA.

5-氨基乙酰丙酸；5-ALA脫水酶；5-ALA合成酶；沼澤紅假單胞菌

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是生物體合成血紅素、葉綠素、VB12等四吡咯化合物的必需前體，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[1-2].近年來，5-ALA不但在醫(yī)藥領(lǐng)域可以作為光動(dòng)力試劑治療淺表型癌癥[3]，而且在農(nóng)業(yè)上可以用作無公害的殺蟲劑、除草劑和植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑[4]，因而引起了人們的廣泛關(guān)注.目前，5-ALA生產(chǎn)主要依賴化學(xué)合成，成本高，收率低，也使得 5-ALA的價(jià)格高居不下(工業(yè)級(jí)5-ALA 600美元/千克，醫(yī)藥級(jí)最高達(dá)800美元/克)，并且存在嚴(yán)重的環(huán)境問題.近年來，研究者們把目光紛紛投向生物法合成5-ALA.

生物體內(nèi)5-ALA的合成途徑有兩種，分別是C4途徑和 C5途徑[5–6].目前生物法生產(chǎn) 5-ALA 大多利用重組外源 C4途徑的大腸桿菌(Escherichia coli)來實(shí)現(xiàn).C4途徑主要存在于動(dòng)物、真菌和一些紫色光合細(xì)菌中，以琥珀酰輔酶 A和甘氨酸為底物，通過 5-ALA 合成酶(5-aminolevulinic acid synthase，ALAS)一步催化合成 5-ALA.生物體中 5-ALA向下代謝的第一個(gè)酶是hemB編碼的 5-ALA脫水酶(5-aminolevulinic acid dehydratase，ALAD)，催化兩分子5-ALA脫水形成一分子膽色素原(porphobilinogen，PBG)[7].目前生物法合成 5-ALA大多采用添加ALAD抑制劑乙酰丙酸(levulinic acid，LA)的策略來降低 5-ALA 的代謝[8–9]，但 LA 價(jià)格昂貴，且主要通過化學(xué)合成法制備，造成5-ALA生產(chǎn)成本增加，發(fā)酵工藝復(fù)雜.近期 Liu等[8]嘗試添加廉價(jià)的葡萄糖作為ALAD抑制劑替代 LA，但葡萄糖既是菌體生長(zhǎng)的碳源，又是 5-ALA合成酶的抑制劑，作用機(jī)理復(fù)雜，難以精確控制.降低 5-ALA在胞內(nèi)繼續(xù)代謝的另一條策略來敲除ALAD的編碼基因hemB，但以往的知識(shí)認(rèn)為該基因是必需基因不能完全缺失，而且野生型大腸桿菌不具備攝入外源血紅素的能力，不能通過直接添加終產(chǎn)物血紅素的方式維持生長(zhǎng)[10].但本研究室的前期工作顯示 hemB缺失的大腸桿菌 ZSEc2可以在普通LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但是與野生菌相比生長(zhǎng)顯著變慢[11].而 McConville等[12]的研究表明通過誘變可以使大腸桿菌獲得攝入外源血紅素的能力，這就使得利用ALAD缺失突變株生產(chǎn)5-ALA成為可能.

基于以上設(shè)想，本文探索了一種利用 ALAD缺失的重組大腸桿菌合成 5-ALA的方法.首先通過對(duì)hemB缺失的大腸桿菌 ZSEc2紫外誘變獲得了在外加血紅素的條件下能夠正常生長(zhǎng)的大腸桿菌突變株，并以此為基礎(chǔ)過表達(dá)來自沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)ATCC 17001的ALAS基因，構(gòu)建的工程菌通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，胞外 5-ALA積累量明顯提高，為生物法合成 5-ALA提供了一條新路線.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌 MG1655、ZSEc2(MG1655ΔhemB)和沼澤紅假單胞菌 ATCC 17001菌株以及表達(dá)載體pET21a和pTrc99A均為實(shí)驗(yàn)室保存.pEasy-Blunt購自北京全式金生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：酵母提取物 5,g/L，蛋白胨 10,g/L，氯化鈉10,g/L(固體培養(yǎng)基額外加2,g/L的瓊脂粉).氨芐青霉素(Amp)終質(zhì)量濃度為100,mg/L，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)終濃度為 0.1,mmol/L，沒有特別說明時(shí)氯化血紅素(hemin)終濃度為40,μmol/L，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化前發(fā)酵培養(yǎng)基中琥珀酸終質(zhì)量濃度10,g/L，甘氨酸終質(zhì)量濃度2,g/L.發(fā)酵培養(yǎng)基主成分為L(zhǎng)B培養(yǎng)基成分.1.1.3 工具酶及試劑

DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶，F(xiàn)ermentas公司；質(zhì)粒小提試劑盒及DNA膠回收試劑盒，Biomiga公司；蛋白定量試劑盒(Pieree’s BCA Assay Kit)，Pierce 公司；基因組提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司.酵母浸出物和胰蛋白胨，英國(guó) Oxoid公司；甘氨酸和IPTG，Promega公司；5-ALA、?；?CoA、對(duì)二甲氨基苯甲醛等，Sigma公司；氯化血紅素，上海生工生物工程有限公司；琥珀酸鈉、葡萄糖、冰醋酸、高氯酸、三氯乙酸、乙酰丙酮、氯仿以及其他常用化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ZSEc2紫外誘變和突變株的篩選

紫外誘變方法參考文獻(xiàn)[13].出發(fā)菌株為hemB缺失的大腸桿菌 ZSEc2，一級(jí)種子液過夜培養(yǎng)，以1∶100比例轉(zhuǎn)接，收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)前期菌液，生理鹽水洗 2次，并用生理鹽水制備成菌懸液(A600＝0.2).將菌懸液注入直徑為 9,cm無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)平皿4,mL，紫外燈功率為 8,W，將平皿固定于紫外燈下40,cm 處，紫外照射時(shí)間分別為 0、10、20、30、40、50,s，然后采用 10倍逐級(jí)稀釋的方法在 LB平板涂布，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，選擇致死率為 80%左右的誘變劑量進(jìn)行操作.誘變菌液稀釋后，涂布血紅素濃度為40,μmol/L的 LB平板，選擇生長(zhǎng)變快的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和生長(zhǎng)比較[14].將誘變菌株分別接種添加不同濃度血紅素(10～70,μmol/L)的 LB 培養(yǎng)基中，37,℃培養(yǎng)，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，比較不同血紅素濃度對(duì)突變株生長(zhǎng)的影響.

1.2.2 沼澤紅假單胞菌基因組DNA的提取

沼澤紅假單胞菌基因組的提取方法參照索萊寶試劑盒說明書.

1.2.3 沼澤紅假單胞菌 ATCC17001的,ALAS基因PCR擴(kuò)增

通過已發(fā)表的同屬的ALAS基因及其上下游序列的比對(duì)，設(shè)計(jì)并合成以下通用引物，上游引物序列為5′-TC(T)AACGGGAGGACA(G/T)TCATGAA-3′，下游引物序列為 5′-CAGCAACGAGACCATCAAGCA-3′.DNA 聚合酶為北京全式金公司的 Fastpfu，PCR擴(kuò)增參數(shù)為 94,℃ 2,min；94,℃ 20,s，60,℃ 20,s，72,℃1,min，循環(huán) 30次；72,℃延伸 5,min.PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并用膠回收試劑盒回收后，連接載體 pEASY-Blunt，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，涂布在含Amp的 LB固體培養(yǎng)基上，藍(lán)白斑篩選后，挑選陽性克隆接于 5,mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒提取驗(yàn)證并測(cè)序.

1.2.4 ALAS表達(dá)載體構(gòu)建及其在大腸桿菌中表達(dá)

根據(jù)測(cè)序所得基因序列，重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ALAS編碼基因，上游引物 5′-GCGCATATG AAT TACGAAGCCTATTTCCGCCGT-3′(下劃線為 NdeI酶切位點(diǎn))，下游引物 5′-CTTAAGCTT TCAGTGG TGGTGGTGGTGGTGGGCCGCCTTGGCGAGACC GAC-3′(下劃線為 HindⅢ酶切位點(diǎn)).PCR 擴(kuò)增參數(shù)為 95,℃ 2,min；95,℃ 20,s，65,℃ 20,s，72,℃ 1,min，循環(huán) 30次；72,℃延伸 5,min.PCR產(chǎn)物回收后用 NdeI和HindⅢ雙酶切并純化，以適當(dāng)比例與NdeI和HindⅢ雙酶切的pET21a載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有Amp的LB平板，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行 PCR和酶切驗(yàn)證.測(cè)序正確的重組載體命名為 pET21a-ALAS.用 XbaI和 HindⅢ對(duì) pET21a-ALAS雙酶切，純化回收 ALAS基因片段，以適當(dāng)比例與XbaI和HindⅢ雙酶切的pTrc99A載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，涂布含有Amp的固體LB平板，驗(yàn)證正確載體命名為 pTrc99A-ALAS并分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌MG1655、ZSEc2和誘變所得菌株.

1.2.5 蛋白電泳及酶活測(cè)定

重組菌株挑單菌落過夜培養(yǎng)，再按初始接種量為A600＝0.05轉(zhuǎn)接新鮮的LB培養(yǎng)基，當(dāng)吸光度約為0.5時(shí)，加入終濃度為 0.1,mmol/L的 IPTG，28,℃誘導(dǎo)過夜，離心收集菌體.菌體用50,mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液沖洗 2次，懸浮超聲破碎，冷凍離心后取上清液用于 SDS-PAGE和酶活分析.蛋白定量方案參見 BCA蛋白定量試劑盒說明書.酶活分析參考文獻(xiàn)[6]，酶反應(yīng)液包括 50,mmol/L Tris-HCl、20,mmol/L MgCl2、0.1,mol/L琥珀酸鈉、0.1,mol/L甘氨酸、0.1,mmol/L磷酸吡哆醛、15,mmol/L ATP、0.2,mmol/L輔酶 A，pH 為 7.5，加入一定量的粗酶液，37,℃反應(yīng)10,min，加入 1/2體積 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，離心取上清液進(jìn)行5-ALA定量，1個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1,nmol/L 5-ALA所需要的酶量.

5-ALA 含量分析按照文獻(xiàn)[15].200,μL 樣液加入100,μL pH 4.6乙酸緩沖液，加入5,μL乙酰丙酮，100,℃水浴 15,min，冷卻至室溫加等體積的 Ehrlish’s試劑(42,mL冰醋酸，8,mL 70%高氯酸，1,g二甲氨基苯甲醛)，顯色 10,min后測(cè) 553,nm 波長(zhǎng)下的吸光度.

1.2.6 血紅素濃度對(duì)突變株胞外5-ALA含量的影響

含有 pTrc99A-ALAS的突變株挑單克隆過夜培養(yǎng)，再按初始接種量為A600＝0.05轉(zhuǎn)接含琥珀酸和甘氨酸以及不同濃度血紅素(10～60,μmol/L)的 LB 培養(yǎng)基中，37,℃培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)前對(duì)數(shù)期添加 IPTG，28,℃誘導(dǎo) 16,h，測(cè)定發(fā)酵液中 5-ALA 的含量，比較不同血紅素濃度對(duì)5-ALA產(chǎn)量的影響.

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基成分優(yōu)化

為了改善重組菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)一步提高胞外 5-ALA的積累量，確定底物以及碳源的最適添加濃度，本研究參考近幾年生物發(fā)酵合成5-ALA的文獻(xiàn)[16-19]，確定了對(duì)菌體生長(zhǎng)和 5-ALA合成影響較大的3個(gè)因素：甘氨酸、琥珀酸、葡萄糖，并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)各因素進(jìn)行評(píng)價(jià).在 LB培養(yǎng)基中，添加琥珀酸、甘氨酸以及葡萄糖.以甘氨酸、琥珀酸和葡萄糖質(zhì)量濃度為考察因素，選取 3個(gè)水平，做 3因素3水平正交實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 突變株的驗(yàn)證及培養(yǎng)條件確定

實(shí)驗(yàn)室前期獲得的hemB結(jié)構(gòu)基因缺失的ZSEc2菌株，在 LB培養(yǎng)基中可以生長(zhǎng)，但與野生型相比非常弱，不能直接用于合成 5-ALA，因此首先對(duì)該菌株進(jìn)行優(yōu)化改造，使其獲得攝入外源血紅素的能力，能夠利用外源血紅素恢復(fù)生長(zhǎng).首先對(duì)ZSEc2菌株進(jìn)行紫外誘變，將紫外照射的菌體涂布含氯化血紅素的LB平板，大腸桿菌K12菌株不能利用外源血紅素，在篩選平板上不能恢復(fù)正常生長(zhǎng)，而獲得攝入外源血紅素能力的突變株可以恢復(fù)生長(zhǎng).在平板上挑取 4個(gè)生長(zhǎng)明顯加快的單克隆，分別編號(hào)為ZGEc1～ZGEc4進(jìn)行菌落 PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖 1所示.核酸凝膠電泳結(jié)果顯示獲得的 4株突變菌株ZGEc1～ZGEc4的目的片段大小為 600,bp，與hemB缺失菌株ZSEc2結(jié)果一致，而含有完整hemB基因的MG1655片段大小為1,410,bp，說明 4個(gè)生長(zhǎng)變快的誘變菌株仍然為hemB基因缺失突變株.

對(duì) ZGEc1～ZGEc4進(jìn)行生長(zhǎng)比較，發(fā)現(xiàn) 4個(gè)菌株都基本恢復(fù)正常生長(zhǎng)，本研究選取生長(zhǎng)最好的ZGEc1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株.對(duì)誘變獲得的突變株 ZGEc1以及對(duì)照菌株 MG1655和 ZSEc2進(jìn)行生長(zhǎng)狀態(tài)的比較，結(jié)果如圖 2所示.與出發(fā)菌株ZSEc2相比，ZGEc1在含有血紅素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)明顯加快，而圖 3顯示外源血紅素濃度在20,μmol/L以上即可使菌體生長(zhǎng)恢復(fù)，以上結(jié)果說明誘變使得 ZGEc1獲得攝入外源血紅素的能力，在外源血紅素存在的條件下生長(zhǎng)良好，可以用于后續(xù)5-ALA工程菌的構(gòu)建.

圖1 菌落PCR驗(yàn)證核酸電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of colony PCR confirmation

圖2 MG1655、ZGEc1和ZSEc2在LB與LB添加血紅素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)比較Fig. 2 Growth comparison of MG1655，ZGEc1 and ZSEc2 incubated in LB or LB with hemin

圖3 血紅素濃度對(duì)ZGEc1生長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effect of hemin concentration on the growth of ZGEc1

2.2 沼澤紅假單胞菌ALAS基因的克隆及表達(dá)

通過 NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以沼澤紅假單胞菌ATCC 17001基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相近的片段(圖 4).測(cè)序發(fā)現(xiàn)ATCC 17001的,ALAS基因的核酸序列(GenBank登陸號(hào)：JQ048720)與沼澤紅假單胞菌 BisB5,hemA基因的核酸序列相似性為 99%，氨基酸序列完全一致.將獲得片段插入表達(dá)載體 pTrc99A，構(gòu)建了帶有沼澤紅假單胞菌ATCC 17001的ALAS基因的重組載體pTrc99A-ALAS.

圖4 沼澤紅假單胞菌ALAS基因片段PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 4 Electrophoresis of the amplified ALAS encoding gene product

重組載體pTrc99A-ALAS轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655和ZGEc1.驗(yàn)證正確后誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖5所示.

圖5 ALAS在MG1655及ZGEc1中表達(dá)的SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE of ALAS expressed in MG1655 and ZGEc1

從SDS-PAGE結(jié)果(圖 5)可以看出ALAS在ZGEc1和MG1655中都能表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度基本一致，粗酶液中ALAS的酶活分別為14.6、13,U/mg，表明hemB缺失及后續(xù)的紫外誘變對(duì)外源 ALAS的表達(dá)和活性沒有太大影響.

2.3 外源血紅素濃度對(duì)胞外5-ALA積累的影響

由于 ALAS受代謝終產(chǎn)物血紅素的反饋調(diào)控，因此首先檢測(cè) ZGEc1/pTrc99A-ALAS在含有不同濃度血紅素的發(fā)酵培養(yǎng)基中胞外 5-ALA的積累量，結(jié)果如圖 6所示.在血紅素濃度低于 40,μmol/L時(shí)，隨著血紅素濃度增加，發(fā)酵液中 5-ALA的產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)血紅素濃度為40,μmol/L時(shí)，胞外5-ALA的積累量達(dá)到最大值，之后隨著血紅素濃度的提高，胞外5-ALA的積累量逐漸減少，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是高濃度的血紅素對(duì) ALAS的活性產(chǎn)生了抑制作用，為了避免外源血紅素對(duì)5-ALA積累的不利影響，將胞外血紅素的添加量確定為 40,μmol/L.同時(shí)，結(jié)果顯示在添加底物和誘導(dǎo)劑 IPTG的培養(yǎng)基中，重組菌的生長(zhǎng)明顯受限，最終在 600,nm的吸光度只有2.2，遠(yuǎn)低于在普通 LB培養(yǎng)基中的最終吸光度，受菌體量的影響，胞外5-ALA的積累量也只有0.313,g/L.

圖6 血紅素濃度對(duì)重組菌胞外5-ALA積累的影響Fig. 6 Effect of hemin on cell growth and 5-ALA accumulation of the recombined strain ZGEc1/pTrc99AALAS

2.4 培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1的數(shù)據(jù)分析，可以首先確定實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合，優(yōu)水平分別為甘氨酸 4,g/L、琥珀酸 10,g/L、葡萄糖 5,g/L，3個(gè)因素的優(yōu)水平組合也是本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)組合.對(duì)實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行極差R分析發(fā)現(xiàn)，3因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序是葡萄糖＞琥珀酸＞甘氨酸.通過 SPSS軟件處理，得到方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表 2.當(dāng)置信度為 95%(P＝0.05)時(shí)，因素臨界值為 F0.05(2，8)＝4.46，F(xiàn)葡萄糖＞F0.05(2，8)，說明葡萄糖為置信度 95%的顯著性影響因素.

最優(yōu)培養(yǎng)基條件下胞外 5-ALA產(chǎn)量達(dá)到0.987,g/L，是未優(yōu)化的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量0.313,g/L的 3.3倍，發(fā)酵液最終在 600,nm 的吸光度也達(dá)到5.5，是未優(yōu)化之前的2.5倍，菌體生長(zhǎng)和胞外5-ALA的產(chǎn)量均達(dá)到較高的水平.

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果極差分析Tab. 1 Design and results of orthogonal experiment

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Tab. 2 Variance analysis of orthogonal experiment

3 結(jié) 語

本研究以 ALAD缺失突變株為出發(fā)菌株完全阻斷5-ALA的代謝途徑，避免了添加昂貴的ALAD抑制劑；通過誘變獲得能夠攝入外源血紅素的突變株，依靠添加少量血紅素即可部分恢復(fù) ALAD缺失菌株的生長(zhǎng)，結(jié)合外源 ALAS的表達(dá)，保證了 5-ALA的積累，建立了一條新的構(gòu)建 5-ALA工程菌的途徑.利用更廉價(jià)的、來源更為廣泛的動(dòng)物血制品作為血紅素替代品的研究有望進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，為5-ALA的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

［1］Choorit W，Saikeur A，Chodok P，et al. Production of biomass and extracellular 5-aminolevulinic acid byRhodopseudomonas palustrisKG31 under light and dark conditions using volatile fatty acid[J]. Journal of Bioscience Bioengineering，2011，111(6)：658-664.

［2］傅維琦，林建平，岑沛霖. 生物法合成5-氨基乙酰丙酸的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代化工，2008，28(S2)：190-193.

［3］Kennedy J C，Pottier R H，Pross D C. Photodynamic therapy with endogenous protoporphyrin IX：Basic principles and present clinical experience[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，1990，6(1/2)：143-148.

［4］Sasaki K，Watanabe M，Tanaka T，et al. Biosynthesis，biotechnological production and applications of 5-aminolevulinic acid[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，58(1)：23-29.

［5］Lin J，F(xiàn)u W ，Cen P. Characterization of 5-aminolevulinate synthase fromAgrobacterium radiobacter，screening new inhibitors for 5-aminolevulinate dehydratase fromEscherichia coliand their potential use for high 5-aminolevulinate production[J]. Bioresource Technology，2009，100(7)：2293-2297.

［6］Van Der Werf M J，Zeikus J G. 5-Aminolevulinate production byEscherichia colicontaining theRhodobacter sphaeroides hemAgene[J]. Applied Environmental Microbiology，1996，62(10)：3560-3566.

［7］Erskine P T，Senior N，Maignan S，et al. Crystallization of 5-aminolaevulinic acid dehydratase fromEscherichia coliandSaccharomyces cerevisiaeand preliminary X-ray characterization of the crystals[J]. Protein Science，1997，6(8)：1774-1776.

［8］Liu X X，Wang L，Wang Y J，et al. D-glucose enhanced 5-aminolevulinic acid production in recombinant Escherichia coliculture[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160(3)：822-830.

［9］何曉梅，周靜，程郢，等. 表達(dá)釀酒酵母 ALAS的重組大腸桿菌胞外 5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量和純化[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2007，23(3)：520-524.

［10］Stojiljkovic I，Hantke K. Hemin uptake system ofYersinia enterocolitica：Similarities with other TonB-dependent systems in gram-negative bacteria[J]. EMBO J，1992，11(12)：4359-4367.

［11］尚柯，郭小飛，王艷萍，等. 5-氨基乙酰丙酸脫水酶缺失對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技，2011，27(7)：742-746.

［12］McConville M L，Charles H P. Mutants ofEscherichia coliK12 permeable to haemin[J]. Journal of General Microbiology，1979，113(1)：165-168.

［13］蔡婉玲，田寶玉，郭菁，等. 蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和紫外誘變育種[J]. 生物技術(shù)，2011，21(1)：73-76.

［14］Letoffe S，Delepelaire P，Wandersman C. The housekeeping dipeptide permease is theEscherichia coliheme transporter and functions with two optional peptide binding proteins[J]. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America，2006，103(34)：12891-12896.

［15］Mauzerall D，Granick S. The occurrence and determination of delta-amino-levulinic acid and porphobilinogen in urine[J]. Journal of Biological Chemisty，1956，219(1)：435-446.

［16］Choi H P，Lee Y M，Yun C W，et al. Extracellular 5-aminolevulinic acid production byEscherichia colicontaining theRhodopseudomonas palustrisKUGB306hemAgene[J]. Journal of Microbiology Biotechnology，2008，18(6)：1136-1140.

［17］Fu W，Lin J，Cen P. 5-Aminolevulinate production with recombinantEscherichia coliusing a rare codon optimizer host strain[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75(4)：777-782.

［18］Xie L，Eiteman M A，Altman E. Production of 5-aminolevulinic acid by anEscherichia coliaminolevulinate dehydratase mutant that overproducesRhodobacter sphaeroidesaminolevulinate synthase[J]. Biotechnology Letters，2003，25(20)：1751-1755.

［19］Xie L，Hall D，Eiteman M A，et al. Optimization of recombinant aminolevulinate synthase production inEscherichia coliusing factorial design[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2003，63(3)：267-273.

Production of 5-aminolevulinic Acid with 5-aminolevulinic Acid Dehydratase DeficientEscherichia coliMutant

GUO Xiaofei1,2,3，CHEN Jiuzhou2,3，ZHANG Lilu2,3，JIA Shiru1，ZHENG Ping2,3
(1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；3. Tianjin Institutes of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China)

5-aminolevulinic acid(5-ALA) is most often biosynthesized by adding 5-ALA dehydratase(ALAD)inhibitorlevulinic acid(LA)to reduce 5-ALA degradation，which leads to the increase of cost and makes the fermentation technology complicated. In this study，we used a 5-ALA dehydratase deficientE. colimutant ZSEc2,as the starting strain. By applying UV mutagenesis，the mutant ZGEc1,was bred and the strain could retrieve normal growth via consumption of extracellular hemin. Then the 5-ALA synthase fromRhodopseudomonas palustriswas over-expressed in the mutant ZGEc1,and a new biosysthesis process of 5-ALA was developed without adding 5-ALA dehydratase inhibiton. After medium optimization，the resultant recombined strain produced about 1,g/L 5-ALA.

5-aminolevulinic acid；5-ALA dehydratase；5-ALA synthase；Rhodopseudomonas palustris

Q815

A

1672-6510(2012)04-0001-06

2012-02-14；

2012-04-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31070037)；中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程項(xiàng)目(KSCX2-EW-Q-13)

郭小飛（1986—），女，山西大同人，碩士研究生；通信作者：鄭 平，副研究員，zheng_p@tib.cas.cn.

郎婧