L－半胱氨酸縮鄰香草醛Co（Ⅱ）配合物的合成、表征及與DNA的作用研究＊

董麗麗，范玉華，劉善斌，張 霞，畢彩豐

（中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，海洋化學(xué)理論工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266100）

氨基酸類希夫堿是一類重要的生物配體，對(duì)該配合物的深入研究，有助于了解生物體中氨基酸與金屬離子間的鍵合作用，有助于揭示金屬離子在生物體內(nèi)的生理生化功能、化學(xué)行為及作用機(jī)理，并對(duì)合理設(shè)計(jì)、目標(biāo)合成和篩選高效、低毒、高選擇性的抗菌、抗癌藥物具有重要的理論價(jià)值。L－半胱氨酸是一種具有生理活性的α－氨基酸，在醫(yī)藥、食品及化妝品等生產(chǎn)中有著廣泛的應(yīng)用［1－2］。DNA是染色體的主要化學(xué)成分，遺傳信息的載體，研究分子與DNA的作用，對(duì)于發(fā)現(xiàn)新的DNA靶點(diǎn)藥物先導(dǎo)化合物具有重要意義。在金屬配合物與DNA相互作用的研究領(lǐng)域，普遍認(rèn)為金屬配合物與DNA共有3種作用方式：靜電作用、溝槽結(jié)合和插入結(jié)合［3－5］。本文首次以L－半胱氨酸和鄰香草醛為原料，制備了L－半胱氨酸縮鄰香草醛配體及其Co（Ⅱ）配合物。通過元素分析，核磁共振、紅外光譜，紫外－可見光譜，摩爾電導(dǎo)分析及TG－DTG等方法對(duì)Co（Ⅱ）配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，確定了該配合物的組成，推測了其可能的結(jié)構(gòu)，并對(duì)Co（Ⅱ）配合物與DNA的作用方式進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料儀器與方法

1.1 儀器與試劑

L－半胱氨酸（L－cys），（天津博迪化學(xué)試劑有限公司），鄰香草醛（ovani），（百靈威），氯化鈉，（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司），六氰合鐵（Ⅱ）酸鉀，（廣東光華化學(xué)廠有限公司），Co（CH3COO）2·4H2O，（中國上海江浦化學(xué)制品廠），無水乙醇，（煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司），無水甲醇，（煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司），二甲基亞砜（DMSO），（天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）均為分析純試劑，使用前未經(jīng)過進(jìn)一步純化。三羥甲基氨基乙烷，（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CT－DNA（日本TCI）均為生化試劑。Vario－EL－cube型元素分析儀（美國），AVANCEⅢ（600 MHz）核磁共振儀（日本電子株式會(huì)社），AVATAR 360 FT－IR型紅外光譜儀（美國），UV－2550紫外－可見分光光度計(jì)（中國北京），DDS－312A型電導(dǎo)率儀（上海大中分析儀器廠），NETZSCH熱重分析儀（德國），日立F－4600熒光光譜儀（中國北京）。

1.2 配體與配合物的合成

1.2.1 配體的合成 稱取1.361 g（10 mmol）乙酸鈉置于100 m L圓底燒瓶中，加入25 m L蒸餾水溶解。將1.212 g（10 mmol）L－半胱氨酸的乙醇溶液加入上述溶液中，攪拌至均勻。再將含有1.522 g（10 mmol）鄰香草醛20 m L乙醇溶液逐滴加入到上述混合溶液中，室溫下攪拌24 h，得白色沉淀，冰浴攪拌1 h，使產(chǎn)物充分沉淀，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌多次，得白色粉末，將產(chǎn)物真空干燥保存。分子式為：C11H13NO4S，相對(duì)分子質(zhì)量為：255.3。Wcal／%：C 51.29，H 4.60，N 5.43，S 12.19；Wmea／%：C 51.70，H 5.09，N 5.48，S12.19。

1.2.2 配合物的合成 稱取0.255 g（1.0 mmol）配體（L－cys－ovani）加入含少量DMSO的甲醇溶液，加熱攪拌使其完全溶解，將含有1.0 mmol的Co（CH3COO）2·4 H2O的乙醇溶液逐滴加入到上述配體溶液中，50℃反應(yīng)4 h，得褐色沉淀，過濾，用甲醇洗滌多次，干燥保存。Wcal／%：C 47.13，H 4.53，N 4.23，S 9.67；Wmea／%：C 47.52，H 4.38，N 4.38，S 9.87。1.3配合物與DNA作用機(jī)理研究所用的表征儀器和分析方法

1.3.1 溶液的配制：（1）緩沖溶液：用二次蒸餾水配制，含5.0×10－3mol·L－1的Tris，5.0×10－2mol·L－1的NaCl，鹽酸調(diào)節(jié)酸度為p H＝7.2。

（2）CT－DNA溶液的配制：稱取5.0×10－3g CT－DNA溶于50 m L p H＝7.2的Tris－HCl緩沖溶液中，使其形成均勻溶液。

（3）Co（Ⅱ）配合物溶液的配制：將Co（Ⅱ）配合物加入到p H＝7.2的Tris－HCl緩沖溶液中，配制濃度約1.0×10－5mol·L－1的溶液。

（4）實(shí)驗(yàn)試樣系列：在10 m L容量瓶中加入一定量的Co（Ⅱ）配合物，再分別加入不同體積的DNA溶液，然后以p H＝7.2的Tris－HCl緩沖溶液定容，避光作用12 h以上。

1.3.2 紫外－可見光譜 向1 cm的比色皿中加入p H＝7.2的Tris－HCl緩沖溶液，用其調(diào)零并作為參比，在200～320 nm波長范圍內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)試樣進(jìn)行掃描。1.3.3熒光光譜 采用1 cm的比色皿，對(duì)試樣進(jìn)行3D掃描，確定配合物的最佳激發(fā)波長，在最佳激發(fā)波長下對(duì)試樣系列測定熒光光譜。

1.3.4 離子強(qiáng)度的影響 在熒光光度計(jì)樣品池中加入一定體積的Co（Ⅱ）配合物和DNA，用微量進(jìn)樣器依次往樣品池中加入一定量的NaCl溶液，使NaCl溶液與Co（Ⅱ）配合物的濃度比值不斷增加，在最佳激發(fā)波長下，測定熒光強(qiáng)度。

1.3.5 熒光猝滅 在熒光光度計(jì)樣品池中加入一定體積的Co（Ⅱ）配合物和DNA，用微量進(jìn)樣器依次往樣品池中加入一定量的K4［Fe（CN）6］溶液，使K4［Fe（CN）6］溶液與Co（Ⅱ）配合物的濃度比值不斷增加，在最佳激發(fā)波長下，測定熒光強(qiáng)度。

1.3.6 黏度測定 在測定黏度時(shí)，溫度恒定在（25±0.1）℃。測定液按固定DNA的濃度，逐漸增加Co（Ⅱ）配合物濃度配置，測定液的相對(duì)黏度按下式計(jì)算［3］：η＝（t－t0）／t0，式中t0表示緩沖溶液流經(jīng)烏氏黏度計(jì)的時(shí)間，t為DNA溶液（含濃度不等的Co（Ⅱ）配合物）流經(jīng)烏氏黏度計(jì)的時(shí)間。以（η／η0）1／3對(duì)r（r＝［Co］／［DNA］）作圖，η0為未加Co（Ⅱ）配合物時(shí)DNA溶液的相對(duì)黏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.11H NMR譜分析 配體和配合物的1H NMR譜圖如下所示。

圖1中，1H NMR（600 MHz CD3SO）：δ10.25（s，1H），歸屬為COOH上的H；δ6.89（m，3H）歸屬為苯環(huán)的H；δ5.84（s，1H）為OH上的H；δ5.64（s，1H）與苯環(huán)相連的次甲基H；δ4.19（t，1H）與羧基相連的次甲基H；δ3.76（d，3 H）甲氧基上的H；δ3.18（m，2H）亞甲基H；δ2.94（s，1H）氨基上的H。通過上述分析，配體在8.6附近沒有化學(xué)位移，說明沒有希夫堿的生成，而是氨基、巰基與醛基發(fā)生了閉環(huán)反應(yīng)，生成了噻唑酸。其結(jié)構(gòu)式如下：

圖2中，與配體相比，Co（Ⅱ）配合物在9.77 ppm處羧基H的化學(xué)位移依然存在，說明羧基并沒有以羧酸根的形式參與配位，配合物在5.50 ppm附近沒有出現(xiàn)化學(xué)位移，說明OH的H已經(jīng)失去，羥基以脫去H原子的方式參與了配位。3.84 ppm處的化學(xué)位移說明甲氧基的氧沒有參與配位，1.21 ppm處出現(xiàn)了新的化學(xué)位移，為醋酸根中甲基上H的化學(xué)位移，說明亞仲配合物中存在醋酸根，2.97 ppm處為仲氨基的H的化學(xué)位移，與配體3.04 ppm相比，發(fā)生偏移，說明仲氨基參與了配位。

2.1.2 紅外光譜 采用KBr壓片法，波長掃描范圍為4 000～400 cm－1。

（1）配體在3 419 cm－1處的吸收峰歸屬為酚羥基的OH伸縮振動(dòng)，3 089 cm－1處的吸收峰為仲氨基的N－H伸縮振動(dòng)峰，也進(jìn)一步說明沒有生成希夫堿。2 900及2 800 cm－1左右的峰歸屬為飽和C－H的伸縮振動(dòng)，2 600及2 400 cm－1處的寬峰說明羧基是以分子間締合的方式存在。1 624 cm－1處的吸收峰為羧酸中羰基的振動(dòng)峰，由于形成了分子間締合，所以使得峰值向低波數(shù)移動(dòng)，1 482 cm－1處的吸收峰可認(rèn)為是C－C單鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 357 cm－1為C－N的伸縮振動(dòng)峰，1 268 cm－1處歸屬為甲氧基的C－O伸縮振動(dòng)峰，而1 065 cm－1可認(rèn)為是酚羥基的C－O振動(dòng)峰。

（2）游離醋酸根離子的υas（coo－）與υs（coo－）大約分別在1 560和1 416 cm－1處［6］，在與過渡金屬離子Co（Ⅱ）形成配合物后，υas（coo－）與υs（coo－）均發(fā)生了變化，υas（coo－）在1 584cm－1處，υs（coo－）出現(xiàn)在1 444 cm－1處，且Co（Ⅱ）配合物中相對(duì)應(yīng)的υas（coo－）與υs（coo－）差值均小于200 cm－1，接近雙齒配位范圍，說明醋酸根的氧原子以雙齒形式參與了配位。Co（Ⅱ）配合物中酚羥基的C－O振動(dòng)峰大約在1 210 cm－1處，與配體相比發(fā)生了明顯的偏移，說明酚羥基參與了配位。Co（Ⅱ）配合物中在3 089 cm－1處附近沒有出現(xiàn)尖峰，說明N參與了配位。而甲氧基的吸收峰沒有明顯偏移，說明甲氧基的O原子沒有參與配位。

2.1.3 紫外－可見光譜 在DMSO溶液中測定配體與Co（Ⅱ）配合物的紫外光譜，Co（Ⅱ）配合物在200～320 nm范圍內(nèi)有2處吸收峰。208 nm處的吸收峰歸屬為苯環(huán)的π–π＊電子躍遷。256 nm處的吸收峰歸屬為配體與金屬離子發(fā)生的LMCT（ligand to metal charge transfer）躍遷，表明金屬離子與配體發(fā)生了反應(yīng)，生成了配合物。

2.1.4 配合物的電導(dǎo)率及摩爾電導(dǎo)率 以DMSO為溶劑，在濃度為0.97×10－3mol·L－1時(shí)，測得Co（Ⅱ）配合物的摩爾電導(dǎo)率為23.12S·cm2·mol－1，其數(shù)值小于35S·cm2·mol－1，可以認(rèn)為該配合物為非電解質(zhì)［7］，即COO－參與了配位。

2.1.5 配合物的熱分解動(dòng)力學(xué)研究 在升溫速率10℃·min－1和N2氛圍條件下，測定了Co（Ⅱ）配合物的熱分析（TG－DTG）曲線，如圖3所示。

圖3 配合物［Co2（C11 H 12 NO4 S）2（CH 3 COO）2］的TG－DTG曲線Fig.3 TG－DTG curves of the［Co2（C11 H 12 NO4 S）2（CH 3 COO）2］

Co（Ⅱ）配合物的熱分解是在室溫至800℃溫度區(qū)間內(nèi)測定的。第一步熱分解的溫度區(qū)間為25～150℃，失重率為13.87%，與失去兩分子醋酸根的計(jì)算值（13.11%）基本相符。150～800℃為配合物的逐步分解過程，溫度至800℃時(shí)，殘重率為19.92%，與理論殘重計(jì)算值19.87%相符，熱分解殘余物為CoO。

2.1.6 配合物可能的結(jié)構(gòu) 由上述表征方法推出Co（Ⅱ）配合物的結(jié)構(gòu)可能如下：

圖4 Co（Ⅱ）配合物可能的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The suggested structure of the Co（Ⅱ）complex

2.2 Co（Ⅱ）配合物與DNA相互作用

2.2.1 Co（Ⅱ）配合物與DNA作用的紫外吸收光譜

紫外可見光譜是研究DNA與金屬配合物結(jié)合方式的有效方法之一。固定配合物的濃度，逐漸加大DNA的濃度，避光靜置12 h后測定其吸光度。從圖5曲線的變化可知，隨著DNA濃度的增加，紫外可見光譜發(fā)生了減色效應(yīng)和微小紅移，這是因?yàn)榕浜衔锏腃o（Ⅱ）離子與DNA的堿基對(duì)發(fā)生了強(qiáng)烈的堆積作用所致。這表明Co（Ⅱ）配合物與DNA的作用方式很可能是插入作用［8］。

圖5 不同濃度DNA與Co（Ⅱ）配合物相互作用的紫外吸收光譜圖Fig.5 Electronic absorption spectra of the Co（Ⅱ）complex with increasing amounts of DNA

2.2.2 Co（Ⅱ）配合物與DNA作用的熒光光譜 Co（Ⅱ）配合物與DNA作用熒光光譜圖如圖6。

圖6 不同濃度DNA與Co（Ⅱ）配合物相互作用熒光光譜圖Fig.6 Emission spectra of Co（Ⅱ）complex with increasing amounts of concentrations of DNA

從熒光光譜圖的變化可知，配合物的熒光強(qiáng)度隨著DNA濃度的增加而增大，這是由于配合物插入到DNA的堿基對(duì)中，使配合物的發(fā)光基團(tuán)進(jìn)入疏水環(huán)境，避免了水分子的猝滅作用，從而使配合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)［9］。這進(jìn)一步表示Co（Ⅱ）配合物與DNA的相互作用方式可能為經(jīng)典插入作用。

2.2.3 離子強(qiáng)度對(duì)Co（Ⅱ）配合物與DNA作用的影響

通過加入NaCl來改變試樣所處的離子強(qiáng)度環(huán)境，也是表征配合物與DNA作用的一種有效的方法。鹽的陽離子可以中和DNA堿基對(duì)上磷酸根所帶的負(fù)電荷，如果配合物通過靜電作用與DNA結(jié)合，那么隨著鹽離子強(qiáng)度的增加，DNA表面會(huì)被Na＋陽離子包圍，從而使配合物難以接近DNA，而使得配合物與DNA的作用減弱，進(jìn)而使熒光強(qiáng)度減弱［10］。當(dāng)配合物與DNA以溝面結(jié)合時(shí)，隨著離子強(qiáng)度的增加，配合物與DNA的結(jié)合減弱導(dǎo)致配合物與DNA分開，熒光強(qiáng)度減弱。而當(dāng)配合物與DNA以插入的方式結(jié)合時(shí)，離子強(qiáng)度則不會(huì)對(duì)配合物與DNA的作用產(chǎn)生明顯的影響。固定DNA及Co（Ⅱ）配合物的濃度，逐漸增加NaCl的濃度，使Na＋的離子強(qiáng)度不斷增加，如圖7所示，隨著離子濃度的增加，熒光強(qiáng)度并沒有發(fā)生明顯的變化，說明Co（Ⅱ）配合物與DNA的作用方式不是靜電作用或溝面結(jié)合，應(yīng)該是以插入方式結(jié)合的。

圖7 NaCl對(duì)Co（Ⅱ）－DNA體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of fluorescence spectra of Co（Ⅱ）－DNA with increasing amounts of NaCl

2.2.4 ［Fe（CN）6］4－對(duì)Co（Ⅱ）配合物與DNA作用的熒光猝滅作用 以［Fe（CN）6］4－作為猝滅劑，比較熒光猝滅劑對(duì)發(fā)光物質(zhì)在結(jié)合DNA作用前后發(fā)光猝滅的差異，是研究配合物與DNA相互作用的另一種簡便而有效的方法［10］。在緩沖溶液中配合物以陽離子的狀態(tài)存在，其熒光被高負(fù)電荷的［Fe（CN）6］4－所猝滅［11］。配合物與DNA發(fā)生插入結(jié)合后，配合物就會(huì)受到DNA的保護(hù)，由于DNA螺旋表面的磷酸根負(fù)電荷的排斥，使猝滅劑很難接近配合物陽離子，則［Fe（CN）6］4－對(duì)配合物的熒光猝滅程度將降低。圖8給出了［Fe（CN）6］4－對(duì)配合物與DNA作用的熒光猝滅曲線。從圖中可見，在無DNA存在時(shí)，Co（Ⅱ）配合物的熒光能被［Fe（CN）6］4－迅速的猝滅，但是當(dāng)Co（Ⅱ）配合物與DNA相互作用后，因受到DNA的保護(hù)，降低了［Fe（CN）6］4－對(duì)Co（Ⅱ）配合物熒光的猝滅效率，同時(shí)由于Co（Ⅱ）配合物與DNA作用以后的猝滅曲線近似于1條斜率為零的直線，進(jìn)一步表明Co（Ⅱ）配合物與DNA是以插入模式作用的。

圖8 ［Fe（CN）6］4－對(duì)Co（Ⅱ）－DNA體系的熒光猝滅曲線Fig.8 Emission quenching curves of the Co（Ⅱ）－DNA by quencher［Fe（CN）6］4－

2.2.5 黏度的測定 光譜學(xué)性質(zhì)的研究雖然得到了一致的結(jié)果，但是仍不足以證明配合物與DNA的結(jié)合方式。為進(jìn)一步明確配合物與DNA的作用方式，本文對(duì)Co（Ⅱ）－DNA體系的黏度進(jìn)行了測定。液體的流動(dòng)性對(duì)體系內(nèi)分子長度的變化非常敏感，因此在缺乏晶體學(xué)數(shù)據(jù)的情況下，黏度法對(duì)配合物與DNA結(jié)合方式進(jìn)行測定是比較可靠的方法。

圖9 Co（Ⅱ）配合物濃度對(duì)DNA黏度的影響［Co］／［DNA］＝0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）Fig.9 Effects of increasing amounts of the Co（Ⅱ）complex on the relative viscosity of DNA［Co］／［DNA］＝0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0

在經(jīng)典的插入作用模式中，DNA的雙螺旋變長，從而使堿基對(duì)分開，以便有足夠的空間來結(jié)合配合物，這使得DNA溶液的黏度增加。與此相反，部分插入或者非經(jīng)典插入中，配合物可以使DNA螺旋彎曲或者扭曲，從而降低了DNA的黏度。還有一些配合物是通過靜電方式與DNA結(jié)合的，對(duì)DNA的黏度沒有影響［12］。如圖9所示，黏度測試的結(jié)果清楚的表明，Co（Ⅱ）配合物可以插入DNA鄰近的堿基對(duì)中，導(dǎo)致DNA螺旋結(jié)果的伸長，從而使DNA的黏度增加。

3 結(jié)語

本文合成了1種新的Co（Ⅱ）配合物，通過元素分析、核磁共振、紅外光譜、紫外－可見光譜、摩爾電導(dǎo)率分析及TG－DTG等手段對(duì)合成的Co（Ⅱ）配合物進(jìn)行了表征，推測雙核配合物的組成為［Co2（C11H12NO4S）－2（CH3COO）2］。進(jìn)一步通過紫外－可見光譜，熒光發(fā)射光譜，離子強(qiáng)度改變，［Fe（CN）6］4－熒光猝滅及黏度測定等方法對(duì)Co（Ⅱ）配合物與CT－DNA結(jié)合方式進(jìn)行了研究，證明Co（Ⅱ）配合物與CT－DNA結(jié)合方式為插入結(jié)合。

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