療癬卡西甫散的藥效學(xué)研究

彭曉明 霍仕霞 吳培培 閆明 高莉

[摘要] 目的：探討療癬卡西甫散的藥效作用，并比較傳統(tǒng)粉末制備與現(xiàn)代工藝制備間藥效的差異。方法：根據(jù)藥物對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂變化的作用以及藥物含藥血清對角質(zhì)形成細胞增殖作用的影響，評價藥效作用，并對比分析傳統(tǒng)粉末制備組（粉末組）與現(xiàn)代工藝制備組（浸膏組）之間的藥效。結(jié)果：療癬卡西甫散各制備組均能夠顯著抑制小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂，對角質(zhì)形成細胞的增殖具有抑制作用,且現(xiàn)代工藝制備組對小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂和角質(zhì)形成細胞的增殖抑制作用較之傳統(tǒng)粉末組有所增強。結(jié)論：療癬卡西甫散對銀屑病具有治療作用，且現(xiàn)代工藝制備組的藥效作用明顯優(yōu)于傳統(tǒng)粉末制備組。

[關(guān)鍵詞] 療癬卡西甫；銀屑病；藥效；評價

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A[文章編號]1673-7210（2011）11（c）-064-03

Study on the effect of Liao Xuan Kaxipu San

PENG Xiaoming1,2, HUO Shixia1,2, WU Peipei3, YAN Ming1,2, GAO Li1,2

1.Pharmaceutical Institute of Xinjiang Uyghur Traditional Medicine, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830049, China; 2.Key Laboratory of Xinjiang Uyghur Traditional Medicine Prescription, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830049, China; 3.College of Pharmaceutical, Shihezi University, Xinjiang Uygur Autonomous Region, Shihezi 832003, China

[Abstract] Objective: To investigate the medicine effect of Liao Xuan Kaxipu San and compare the effect differences between traditional powder and modern technics. Methods: The medicine effect differences were evaluated by observing the mitosis changes in mice vaginal epithelial cell and the influence of the proliferation effect to keratinocytes in medicated serum, then the medicine effects between traditional powder group (powder group) and modern technics group (extracts group) were compared and analysed. Results: All groups of the Liao Xuan Kaxipu San could restrain the mitosis in mice vaginal epithelial cell and the proliferation effect to keratinocytes, and the inhibition effect in the modern technics group was stronger than that in the traditional powder group. Conclusion: The Liao Xuan Kaxipu San has treatmental effect on psoriasis and the effect of the modern technics is better than that of the traditional powder group.

[Key words] Liao Xuan Kaxipu San; Psoriasis; Medicine effect; Evaluate

銀屑病是常見的慢性炎癥性皮膚病之一，頑固且易復(fù)發(fā)。由于其發(fā)病機制較為復(fù)雜，且有機體免疫系統(tǒng)參與，因而其治療在世界范圍內(nèi)仍屬醫(yī)學(xué)難題。銀屑病在維吾爾醫(yī)學(xué)中被稱之為“庫岜”，目前其發(fā)病機制尚未完全明確[1]。維吾爾醫(yī)理論認為，人體內(nèi)堿性黏液質(zhì)過剩及沉積，阻止血液的正常運行，機體氣質(zhì)異常，影響了皮膚的營養(yǎng)力、攝住力、生長力等，從而導(dǎo)致了銀屑病的發(fā)生[2]。療癬卡西甫散是在維吾爾醫(yī)藥學(xué)古方的基礎(chǔ)上研制而成的復(fù)方制劑，被廣泛應(yīng)用于皮膚瘙癢、體癬、銀屑病等皮膚疾病的治療。該藥由歐菝葜（洋菝葜）、菝葜和黃連三味主藥組成，具有燥濕、止癢、清除堿性異常黏液質(zhì)的作用[3]。本實驗主要通過研究療癬卡西甫散傳統(tǒng)粉末制劑與現(xiàn)代工藝提取浸膏對小鼠銀屑病模型（體內(nèi)）和角質(zhì)形成細胞（體外）的藥效作用，為療癬卡西甫散的臨床用藥、藥理學(xué)研究以及劑型的改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實驗動物與細胞培養(yǎng)

昆明小鼠，體重（20±2） g；SD大鼠，體重180～200 g，均由新疆實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2003-0002，使用許可證號：SYXK（新）2003-0003。

人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCat購自于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。將HaCat細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

己烯雌酚注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H31021403）、消銀顆粒（陜西康惠制藥股份有限公司，國藥準字Z20000019），噻唑藍、秋水仙堿（Sigma公司）、高糖（DMEM）培養(yǎng)基（GIBCO產(chǎn)品）、胎牛血清（杭州四季青生物工程科技有限公司）、氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素（Amersco公司）。

1.3 實驗用藥

療癬卡西甫散傳統(tǒng)粉末制備組由山東倍力公司負責藥材的超微粉碎。療癬卡西甫散浸膏組由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究室提取濃縮，重新組方。

2 方法與結(jié)果

2.1 療癬卡西甫散對小鼠陰道上皮細胞模型的抑制作用

取昆明種雌性小鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，稱取體重，隨機分成8組，分別為空白對照組、消銀顆粒組（陽性藥組）、粉末高劑量組、粉末中劑量組、粉末低劑量組、浸膏高劑量組、浸膏中劑量組、浸膏低劑量組。參照文獻方法[4-5]，各組小鼠以0.2 mg的己烯雌酚腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d，使小鼠處于雌激素期。從第4天起，開始對小鼠灌胃給藥?？瞻讓φ战M用生理鹽水灌胃，陽性藥組灌以消銀顆粒1.365 g/kg。粉末高劑量組和浸膏高劑量組（20×臨床用藥劑量）濃度為10.4 g/kg，粉末中劑量組和浸膏中劑量組（10×臨床用藥劑量）濃度為5.2 g/kg，粉末低劑量組和浸膏低劑量組（5×臨床用藥劑量）濃度為2.6 g/kg，每日1次，連續(xù)給藥30 d，所有用藥劑量均折算成生藥量。期間，所有小鼠每隔2 d注射1次己烯雌酚，以穩(wěn)定動物模型。末次（給藥第30天）給藥1 h后，所有小鼠注射秋水仙堿2 mg/kg或長春新堿6 mg/kg，使有絲分裂停止于M期便于計數(shù)，5 h后處死小鼠。取小鼠陰道標本，用10%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色。制片流程：石蠟切片→二甲苯脫蠟→無水乙醇→95%酒精→水洗→蘇木素→HCl分化→水洗→伊紅染色→95%酒精→無水乙醇→二甲苯→光學(xué)樹膠封片→烘片。病理切片制備完成后，在光學(xué)顯微鏡（最好目鏡帶有刻度，便于計數(shù)）下觀察小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂情況，拍照。并計算出200個基底細胞的有絲分裂數(shù)，然后核算出每100個細胞的有絲分裂數(shù)。利用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，并進行t檢驗，以此評價療癬卡西甫散對小鼠陰道上皮細胞模型的抑制作用。具體的結(jié)果，見圖1和表1。

1.空白對照組；２.陽性藥組；３.粉末低劑量組；４.浸膏低劑量組；

５.粉末中劑量組；６.浸膏中劑量組；７.粉末高劑量組；８.浸膏高劑量組

在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理切片（圖1）及統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析（表1）結(jié)果顯示，小鼠陰道上皮有絲分裂細胞主要分布在基底層，空白對照組中有絲分裂（核分裂）數(shù)最多，表明銀屑病小鼠陰道上皮細胞有絲分裂模型造模成功。與空白對照組比較，療癬卡西甫散粉末組和浸膏組對該模型均具有不同程度的有絲分裂抑制作用。此外，在相同給藥劑量水平下，浸膏組在對小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂的抑制方面，作用較之粉末組均有所增強。這可能與傳統(tǒng)粉末制備組的有效藥物成分始終保留在植物組織細胞之內(nèi)有關(guān)，因細胞壁的阻隔作用，影響了機體對藥效成分的直接吸收。

2.2 療癬卡西甫散含藥血清對HaCat細胞的增殖作用

選取40只SD大鼠，稱取體重，隨機分成8組，每組5只，分別為正常組、消銀顆粒組（陽性藥組）、粉末高劑量組、粉末中劑量組、粉末低劑量組、浸膏高劑量組、浸膏中劑量組、浸膏低劑量組。SD大鼠禁食12 h后，空白對照組用0.5%的CMC-Na灌胃，陽性藥組灌以消銀顆粒1.365 g/kg，其余各組用藥劑量均折算成生藥量，粉末高劑量組和浸膏高劑量組（20×臨床用藥劑量）濃度為10.4 g/kg，粉末中劑量組和浸膏中劑量組（10×臨床用藥劑量）濃度為5.2 g/kg，粉末低劑量組和浸膏低劑量組（5×臨床用藥劑量）濃度為2.6 g/kg，每天給藥2次，連續(xù)給藥3 d。末次給藥2 h后，乙醚麻醉，腹主動脈取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，56℃水浴滅活后，超凈工作臺中0.22 μm過濾除菌，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ?shù)期生長的HaCat細胞以1.0×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl；24 h后棄培養(yǎng)液，加入粉末和浸膏的高、中、低3種劑量含藥血清和正常血清，各組設(shè)20%的血清濃度，每孔均為100 μl，設(shè)8個復(fù)孔；共培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），孵育4 h，棄上清，每孔加入200 μl DMSO，待沉淀充分溶解后，用酶標儀測定490 nm波長下光密度（optical density，OD）值。生長抑制率=（1-給藥組OD值/空白組OD值）×100%。見表2。

根據(jù)生長抑制率公式可知，生長抑制作用的強弱與藥物的OD值密切相關(guān)，并呈一定的負相關(guān)。由表2的HaCat細胞給藥結(jié)果顯示，無論是傳統(tǒng)粉末制劑還是提取后的浸膏制劑，均對HaCat細胞的增殖具有抑制作用（各給藥組OD490明顯較空白對照組降低），這表明療癬卡西甫散具有治療銀屑病的作用。利用t檢驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取后，浸膏組對HaCat細胞的增殖抑制作用要明顯強于傳統(tǒng)的粉末制劑組。

3 討論

銀屑病的治療相當復(fù)雜漫長，但維吾爾醫(yī)藥在治療該病方面具有其獨到之處。根據(jù)新疆40多家維吾爾醫(yī)醫(yī)院對銀屑病的治療效果顯示，維吾爾醫(yī)藥在治療銀屑病方面，具有療效顯著，無毒副作用的特點。維吾爾醫(yī)學(xué)非常重視人體的整體性，系統(tǒng)治療，內(nèi)外同治。依據(jù)維吾爾醫(yī)理論，銀屑病的病變雖在皮膚局部，但機體內(nèi)環(huán)境的改變卻是最為重要的。因而，銀屑病的治療應(yīng)平衡體液，調(diào)整氣質(zhì)。清除堿性黏液質(zhì)和異常黑膽質(zhì)以清血之熱，止癢消炎為主[6]。銀屑病的發(fā)病機制，迄今為止仍無定論?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，銀屑病患者大都表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞的過度增殖和分化異常[7]。當前，銀屑病治療藥物的臨床研究資料中，其非臨床有效性評價所選模型，均選擇了3個主要試驗進行，即對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂的影響試驗、對大鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成的影響試驗、對動物心得安致耳廓皮損的試驗[8]。該3項試驗均是針對銀屑病患者表皮的主要病理特點而設(shè)計，即角質(zhì)形成細胞的過度增殖和分化異常。

療癬卡西甫散是維吾爾醫(yī)治療銀屑病的常用藥方，目前關(guān)于該復(fù)方的研究資料很少，對于其治療銀屑病的作用機制也不明確。本研究分別通過動物體內(nèi)（小鼠銀屑病模型）和體外（角質(zhì)形成細胞HaCat）藥效學(xué)實驗，揭示了療癬卡西甫散可能是通過抑制角質(zhì)形成細胞的過度增殖，來達到治療目的的。但是，該藥對角質(zhì)形成細胞的增殖抑制機制，仍需進一步通過細胞和分子生物學(xué)實驗來闡明。此外，療癬卡西甫散是維吾爾藥僅有的幾個散劑當中的一個具有清除堿性異常黏液質(zhì)的復(fù)方制劑。盡管其散劑粉狀顆粒的比表面積大、容易分散、起效快、劑量容易控制，但由于其吸濕性較強，顆粒極易聚集，表面會形成一層水系黏膜，不利于機體對藥效成分的吸收。加之，傳統(tǒng)粉末制劑的有效藥物成分仍保留在植物組織細胞之內(nèi)，因細胞壁的阻隔作用，阻礙了機體對藥效成分的直接吸收。這些都可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)粉末制劑不如現(xiàn)代工藝提取制劑組藥物作用效果的原因。因而，利用現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)技術(shù)研究高效的維吾爾醫(yī)制劑，突出維吾爾醫(yī)的特色，是維吾爾醫(yī)藥發(fā)展的必由之路。本研究通過在相同給藥劑量下，比較療癬卡西甫散傳統(tǒng)粉末制備組和現(xiàn)代工藝制備組的藥效作用，從而為療癬卡西甫散傳統(tǒng)粉末制劑的制備工藝現(xiàn)代化奠定理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2011-07-12）

[基金項目] 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（項目編號：2009211B38）。

[作者簡介] 彭曉明（1983-），男，碩士，助理研究員；研究方向：分子藥理學(xué)。

[通訊作者] 高莉（1981-），女，2009級在讀博士，助理研究員；研究方向：皮膚病分子藥理。