四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鑒定

包秋華， 呂嬙， 于 潔， 王宏梅， 張和平， 孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鑒定

包秋華， 呂嬙， 于 潔， 王宏梅， 張和平， 孫天松＊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

為準(zhǔn)確鑒定分離自我國(guó)四川鮮牦牛奶和曲拉中9株乳酸菌到種水平，作者運(yùn)用16S r DNA序列分析、rec A基因特異擴(kuò)增和hsp60－RFLP等多種分子技術(shù)對(duì)分離自我國(guó)四川地區(qū)鮮牦牛奶和曲拉中的9株乳酸菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定。結(jié)果證實(shí)，16S r DNA序列分析法可將9株乳酸菌初步歸類(lèi)為植物乳桿菌群（4株），腸膜明串珠菌（4株），瑞士乳桿菌（1株）。由于16S r DNA序列分析法不能區(qū)分植物乳桿菌和戊糖乳桿菌，為了進(jìn)一步鑒定植物乳桿菌群中的4株菌，繼續(xù)采用recA基因特異擴(kuò)增和hsp60－RFLP技術(shù)對(duì)其細(xì)分，結(jié)果表明rec A基因特異擴(kuò)增和hsp60－RFLP的方法均能很好地把植物乳桿菌群中的4株菌鑒定到種水平，且均為植物乳桿菌。

乳酸菌；分類(lèi)鑒定；16S r DNA；recA基因；hsp60基因；RFLP

乳酸菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性、細(xì)胞形態(tài)為桿菌或球菌、過(guò)氧化氫酶為陰性、不形成內(nèi)生孢子、利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生50%以上乳酸的細(xì)菌的通稱［1］。廣泛地存在于自然界、動(dòng)植物體、乳制品和發(fā)酵食品中，且大多數(shù)為非致病菌，屬于有益微生物，具有改善腸道菌群、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、降低血液膽固醇、降血壓等功能［2］，是人體正常菌群。牦牛乳和曲拉具有獨(dú)特的生態(tài)學(xué)特性和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)含有種類(lèi)豐富的微生物，如可檢測(cè)到很多屬、種的乳酸菌［3－5］。

乳酸菌的分類(lèi)鑒定方法很多，總的來(lái)說(shuō)可分為經(jīng)典方法和分子生物學(xué)方法。經(jīng)典方法包括形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及血清學(xué)反應(yīng)等，這些方法都是基于微生物表面受體的特異性，屬于表型分類(lèi)法。由于乳酸菌大多屬于兼性厭氧菌，且其對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求具有復(fù)雜性；傳統(tǒng)食品是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境系統(tǒng)，其中可能會(huì)存在許多人們尚未發(fā)過(guò)的乳酸菌菌種；傳統(tǒng)的表型、生物化學(xué)方法鑒定微生物耗時(shí)耗力等原因，最終可能導(dǎo)致鑒定結(jié)果不穩(wěn)定［6］。而分子生物學(xué)方法是在分子水平上對(duì)生物個(gè)體的核酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，根據(jù)獲得的基因型信息對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行分類(lèi)，從分子和基因水平來(lái)認(rèn)識(shí)乳酸菌的遺傳結(jié)構(gòu)、組成和分類(lèi)。目前，許多新的分子標(biāo)記技術(shù)被用來(lái)進(jìn)行乳酸菌的鑒定：如16S r DNA序列分析［7］和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），即PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)等，其中基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記又可分為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA （Randomly Amplified Polymorphic DNA）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism）等［8－10］。其中16S r DNA是細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)學(xué)中最有用的和最常用的分子鐘，其進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。16S大小適中，約1.5 kb左右，方便用于PCR擴(kuò)增和測(cè)序，故被細(xì)菌學(xué)家及分類(lèi)學(xué)家所接受，成為系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法。16S rDNA結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，不同細(xì)菌的恒定區(qū)序列基本保守，而可變區(qū)序列則因細(xì)菌而異。所以，可以根據(jù)其恒定區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物將16S r DNA擴(kuò)增出來(lái)，利用可變區(qū)序列的差異來(lái)對(duì)不同的。

，16S r D NA序列分析也是最常用的方法之一，對(duì)有些相近種需要采用其他分子標(biāo)記技術(shù)做補(bǔ)充。

作者以分離自四川地區(qū)的鮮牦牛奶和采用傳統(tǒng)方法制作曲拉樣品中分離得到的乳酸菌為研究對(duì)象，首先運(yùn)用16S r DNA序列分析將其初步鑒定，部分乳酸菌屬于植物乳桿菌群，由于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和戊糖乳酸菌（Lactobacillus pentosus）之間的16S r DNA序列同源性為99%以上，難以從16S r DNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上區(qū)分，故繼續(xù)采用recA基因特異擴(kuò)增和hsp60－RFLP相結(jié)合的技術(shù)，對(duì)乳酸菌分離株進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，是從四川牧民家庭采集的鮮牦牛奶和以傳統(tǒng)方法制作的曲拉中分離得到的9株乳酸菌，菌號(hào)分別為IMAU80248，IMAU80249，IMAU80250，IMAU80251，IMAU80252，IMAU80286，IMAU80297，IMAU80323，IMAU80325。標(biāo)準(zhǔn)菌Lactobacillus plantarumATCC 14917，Lactobacillus pentosusATCC 8041：購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）。

1.2 試劑與儀器

10 g／d L脫脂乳培養(yǎng)基、TPY液體培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)［11］制備；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等：購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；5810R型Eppendorf冷凍離心機(jī)、ND－1000型微量紫外分光光度計(jì)、PTC－200型梯度基因擴(kuò)增儀：均購(gòu)自基因有限公司。

1.3 所用引物

PCR擴(kuò)增乳酸菌的16S r RNA、recA和hsp60基因引物見(jiàn)表1，所有引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 乳酸菌基因組總DNA提取及純度的檢測(cè)

將分離純化的真空冷凍干燥保存的9株乳酸菌接種于5 m L滅菌的10 g／d L脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃、培養(yǎng)24～48 h，活化培養(yǎng)三代。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢確定為純培養(yǎng)物后，將分離株接種于3 m LTPY液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)24 h。離心收集菌體后按液氮凍融－CTAB法［8］提取基因組總DNA，并采用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA的濃度和純度。

表1 擴(kuò)增乳酸菌16S r RNA、rec A和hsp60基因擴(kuò)增引物Tab.1 Primers used for amplification of 16S r RNA，rec A and hsp60 gene in Lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌16S rDNA擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將提取的基因組DNA稀釋到100 ng／μL左右作為PCR擴(kuò)增的模板，采用通用引物27f和1495r［7，9］擴(kuò)增9株乳酸菌的16S r RNA 基因。PCR反應(yīng)體系（50μL）的配制：10×PCR Buffer 5μL，上下游引物各1.5μL （10μmol／μL），模板 DNA 1.5μL（100 ng／μL），d NTP Mix 4μL，r Taq酶0.5 μL，超純水補(bǔ)充至50μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5 min預(yù)變性；94℃1 min，58℃1 min，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1.0 g／d L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將16S r DNA擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送上海桑尼生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

將 測(cè) 序 得 到 的 序 列 用 BLAST （http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／）在 GenBank中搜索，與待測(cè)菌株同源性最高的已知分類(lèi)地位的菌種初步確定待測(cè)菌株的種屬。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已知的乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列，使用軟件Mega4.0作16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2.3 rec A基因鑒定L.plantarum群的乳桿菌

RecA基因?qū)τ贚.plantarum群的特異性較高，因此以相應(yīng)的L.plantarum群的recA基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物［12］，分別以planF、pentF為正引物，p REV為反引物。PCR反應(yīng)體系（25μL）的配制：10×PCR Buffer 2.5μL，上下游引物各1.0μL（10 μmol／μL），模板 DNA 1μL （100 ng／μL），d NTP Mix 2μL，r Taq酶0.3μL，超純水17.2μL。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：94℃3 min預(yù)變性；94℃變性30 s，56℃復(fù)性10 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min。

2.4 hsp60 基 因 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物－RFLP 標(biāo) 記L.plantarum 群的乳桿菌

采 用 表1中 引 物 H729和 H730［13］擴(kuò) 增L.plantarum群的乳桿菌hsp60基因。PCR反應(yīng)體系（25μL）的配制：10×PCR Buffer 2.5μL，上下游引物各1.0μL（10μmol／μL），模板DNA 1μL（100 ng／μL），d NTP Mix 2μL，r Taq酶0.3μL，超純水17.2μL。擴(kuò)增條件為：95℃3 min預(yù)變性；95℃變性30 s，40℃復(fù)性90 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。采用NEBcutter 2分析已知L.plantarum和L.pentosus的hsp60序列的酶切位點(diǎn)，選用合適的限制性內(nèi)切酶HhaI對(duì)L.plantarum群的乳桿菌hsp60基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切即：酶切反應(yīng)總體積為20μL，含2μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，2 U內(nèi)切酶和2μL10×反應(yīng)緩沖液。37℃消化3 h，消化完畢在酶切產(chǎn)物中加0.5倍體積的10×Loading Buffer終止酶切，取6 μL酶切產(chǎn)物用5 g／d L聚丙烯酰胺膠（PAGE）凝膠電泳，銀染并將凝膠用掃描儀成像。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA提取結(jié)果

通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定9株待測(cè)乳酸菌DNA的濃度和純度。A260／A280比值在1.8～2.0范圍內(nèi)，1.0 g／d L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1?；蚪MDNA在23 kb處，DNA條帶清晰。從OD比值和DNA濃度可看出提取DNA質(zhì)量較好，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA of Lactic acid bacteria

3.2 乳酸菌16S r DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

16S r RNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物于1 g／d L瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)溴化乙錠染色拍照，見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，PCR擴(kuò)增比較成功，達(dá)到預(yù)期效果，即在1 500 bp附近均有清晰可見(jiàn)的明亮條帶，并且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶，故9株待測(cè)菌株的16S r DNA擴(kuò)增產(chǎn)物可以測(cè)序。

圖2 乳酸菌16S r DNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of 16S rDNA in Lactic acid bacteria

3.3 測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

通過(guò)對(duì)序列測(cè)定結(jié)果分析可知，9株待測(cè)乳酸菌的16S r DNA序列長(zhǎng)度為1 500 bp左右。由待測(cè)9株乳酸菌的16S r DNA序列與8株參考菌株的16S r DNA序列用Mega4.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。從總體上可將這9株待測(cè)乳酸菌分為3大群：即L.plantarumATCC 14917、L.pentosusATCC 8041、IMAU 80296、IMAU 80297、IMAU 80323和IMAU 80325為第一群；IMAU 80252和L.helveticusATCC 15009為第二群；Leuconostoc mesenteroidesATCC 8293、IMAU 80248、IMAU 80249、IMAU 80250和IMAU 80251為第三群。通過(guò)BLAST序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析可知，第一類(lèi)群菌株中IMAU 80296、IMAU 80297、IMAU 80323 和 IMAU 80325 與L.plantarumATCC 14917和L.pentosusATCC 8041相似性均達(dá)到99%以上，暫歸為植物乳桿菌群，這4株菌還需要采用其他方法進(jìn)一步鑒定；第二類(lèi)群菌株中IMAU 80252與Lactobacillus helveticusATCC 15009的同源性在99%以上，從而將其歸屬為瑞士乳桿菌；第三類(lèi)群菌株IMAU 80248、IMAU 80249、IMAU 80250和IMAU 80251與菌株Leuconostoc mesenteroidesATCC 8293的同源性達(dá)99%以上，故判定此4株菌為腸膜明串珠菌。

3.4 rec A基因鑒定

利用recA基因進(jìn)一步鑒定植物乳桿菌群中的4株菌，經(jīng)PCR反應(yīng)可得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的PCR產(chǎn)物，L.pentosus的 PCR 產(chǎn)物 為218 bp，L.plantarum的PCR產(chǎn)物為318 bp［12，14］。由圖4可得：菌株 IMAU 80325、IMAU 80297、IMAU 80296、IMAU 80323 與 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株L.plantarumATCC 14917條帶一致，因此可將待測(cè)4菌株鑒定為植物乳桿菌。

3.5 hsp60酶切產(chǎn)物－RFLP電泳圖譜及結(jié)果

為了更準(zhǔn)確鑒定植物乳桿菌群中的4株菌，進(jìn)一步采用hsp60／HhaI－RFLP法鑒定。由圖5可知：待測(cè)菌株IMAU 80296、IMAU 80297、IMAU 80323和IMAU 80325與標(biāo)準(zhǔn)菌株L.plantarumATCC 14917條帶一致，但與標(biāo)準(zhǔn)菌株L.pentosusATCC 8041存在差異。因此可將菌株IMAU 80296、IMAU 80297、IMAU 80323和IMAU 80325鑒定為植物乳桿菌，同時(shí)能夠看出經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶HhaI可以完成對(duì)植物乳桿菌和戊糖乳桿菌 的區(qū)分。

圖3 乳酸菌16S r DNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence analyses

圖4 rec A基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of rec A in Lactic acid bacteria

4 結(jié)語(yǔ)

圖5 hsp60／Hha I－RFLP的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.5 Polyacrylamide gel electrophoresis of Hsp60／Hha IRFLP

以乳酸菌16S r DNA序列測(cè)定為基礎(chǔ)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步揭示9株乳酸菌的親緣關(guān)系。由于植物乳桿菌群（植物乳桿菌和戊糖乳桿菌）的16S r DNA序列同源性為99%，難以從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上區(qū)分到種的水平。為了進(jìn)一步鑒定植物乳桿菌群中的4株菌，采用recA－PCR和hsp60－RFLP相結(jié)合的技術(shù)，結(jié)果表明兩種方法鑒定結(jié)果相同，即菌株IMAU 80296、IMAU 80297、IMAU 80323 和IMAU 80325全部為植物乳桿菌。綜上所述，作者通過(guò)16S r DNA序列測(cè)定，并結(jié)合recA－PCR和hsp60－RFLP技術(shù)，成功將9株乳酸菌準(zhǔn)確鑒定到種的水平，為其他部分乳酸菌的分子鑒定提供了簡(jiǎn)便快速的方法。

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Molecular Identification of Nine Strains Lactic Acid Bacteria Isolated from Yak Milk and Triton in Sichuan

BAO Qiu－h(huán)ua，LU Qiang，YU Jie，WANG Hong－mei，ZHANG He－ping，SUN Tian－song＊

（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

In this study，To accurately identify lactic acid bacteria（LAB）that were isolated from fresh yak milk and Qula in Sichuan region of China，nine LAB strains were classified and identified to species level by using 16S r DNA sequencing analysis，multiplex PCR assay of rec A gene，hsp60－PCR－RFLP analysis etc.The results showed that nine LAB strains were initially characterized as Lactobacillus plantarum group （4 strains），Leuconostoc mesenteroides（4 strains）andLactobacillus helveticus（1 strain）by 16S r DNA sequencing analysis.However，16S r DNA sequencing analysis could not distinguish betweenL.plantarumandL.pentosus.For further identification of strains inL.plantarumgroup，multiplex PCR assay ofrecA gene andhsp60－RFLP analysis were conducted.The results revealed that multiplex PCR assay ofrecA gene andhsp60－RFLP could identifyL.plantarumgroup to species level and 4 LAB strains inL.plantarumgroup were identified asL.plantarum.

lactic acid bacteria，identification，16S r DNA，RecA gene，Hsp60，RFLP

＊通信作者：孫天松（1967－），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事乳品微生物方面的研究。Email：sts9940＠sina.com

Q 789

A

1673－1689（2012）04－0396－06

2011－03－23

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)重點(diǎn)項(xiàng)目（30860219）；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2010Zd15）。

包秋華（1973－），女，內(nèi)蒙古赤峰人，乳品生物技術(shù)與工程博士研究生，助理研究員，E－mail：nmgbqh＠126.com