茉莉酸甲酯對(duì)甘草根次生代謝的調(diào)控

梁曉薇，楊 全，李 丹，程軒軒，唐曉敏，潘利明，張春榮

（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006）

茉莉酸甲酯對(duì)甘草根次生代謝的調(diào)控

梁曉薇，楊 全，李 丹，程軒軒，唐曉敏，潘利明，張春榮

（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006）

為探討茉莉酸甲酯（MeJA）對(duì)甘草根次生代謝的調(diào)控及其機(jī)制，分別用20、50、100 μmol/L的MeJA噴施甘草葉片，高效液相色譜法測(cè)定甘草根中甘草酸和甘草苷等有效成分含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析甘草根次生代謝途徑重要酶β-香樹脂醇合酶（GubAS）、β-香樹脂醇-11-氧化酶（GubAO）、6-脫氧查爾酮合酶（GuDOCS）基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，20、50 μmol/L MeJA溶液處理的甘草酸含量得到極顯著提高，100 μmol/L MeJA溶液處理的甘草酸含量與對(duì)照無顯著差異；20、50 μmol/L MeJA溶液對(duì)甘草苷的積累沒有顯著影響，而100 μmol/L MeJA溶液處理的甘草苷含量降低。20 μmol/L MeJA溶液處理甘草0～6 h對(duì)GubAS、GuDOCS基因的表達(dá)均有促進(jìn)作用，處理2～6 h對(duì)GubAO的表達(dá)也有促進(jìn)作用；50 μmol/L MeJA溶液處理0～2 h對(duì)GubAS、GubAO、GuDOCS基因的表達(dá)水平都有提高作用，但隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，3個(gè)基因表達(dá)均恢復(fù)處理前水平；100 μmol/L MeJA溶液對(duì)GubAS和GubAO表達(dá)均無顯著影響，GuDOCS表達(dá)量在100 μmol/L MeJA溶液處理2 h時(shí)得到提高，隨后逐漸下降，并在處理24 h后出現(xiàn)降低現(xiàn)象。推斷中低濃度MeJA在處理初期對(duì)甘草有效成分生物合成水平有上調(diào)的作用，隨著處理濃度提高與時(shí)間延長(zhǎng)，MeJA的促進(jìn)作用逐漸減弱，甚至出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。

甘草；茉莉酸甲酯；基因表達(dá)；次生代謝

Abstract：To investigate the regulation mechanism of methyl jasmonate （MeJA） on secondary metabolism of Glycyrrhiza uralensis root，the G. uralensis seedlings were treated by 20，50，100 μmol/L MeJA. After 9 d，the contents of active ingredients in G. uralensis roots were detected by high performance liquid chromatography（HPLC）. And the expression patterns of key enzymes on biosynthetic pathway in G. uralensis roots treated by MeJA for 0，2，6，12，24，36，72 h were analyzed by real-time PCR. The results showed that the contents of glycyrrhizic acid in G. uralensis roots improved in both middle and low concentrations of MeJA，whereas the contents of liquiritin reduced in high concentrations of MeJA. The expression of GubAS，GubAO in G. uralensis roots were promoted by 20 and 50 μmol/L MeJA，and the expression of GuDOCS was promoted by 20 μmol/L MeJA. However，100 μmol/LMeJA suppressed GubAS and GuDOCS expression. All three genes expression reached the highest level at 6 h under the induction of 20 μmol/L MeJA. It can be concluded that MeJA in middle and low concentrations have the upregulation effect on biosynthesis of glycyrrhizic acid. However only low concentration can promote the biosynthesis of liquiritin.

Key words：Glycyrrhiza uralensis Fisch；methyl jasmonate；gene expression level；secondary metabolism

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）為豆科多年生草本植物，其根及根莖為常用中藥，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效［1］，被廣泛用于食品、化妝品等領(lǐng)域。市場(chǎng)對(duì)甘草的大量需求導(dǎo)致野生資源枯竭，同時(shí)人工栽培的商品甘草良莠不齊，有的甚至低于《中國(guó)藥典》要求［2］，如何提高栽培甘草的品質(zhì)成為目前甘草行業(yè)亟需解決的關(guān)鍵問題。

甘草有效成分主要是甘草苷為主的黃酮類化合物和甘草酸為主的三萜皂苷類化合物，二者也是《中國(guó)藥典》評(píng)價(jià)甘草品質(zhì)的主要指標(biāo)［1］。甘草苷和甘草酸具有抗氧化［3］、抗病毒［4］、抗炎［5］等生物活性，是甘草適應(yīng)生存環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。甘草為陽生旱生植物，適度干旱脅迫能夠促進(jìn)甘草根中甘草苷和甘草酸的積累［6-7］。我們對(duì)適度干旱脅迫下甘草根的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序和分析發(fā)現(xiàn)，適度干旱脅迫能夠促進(jìn)茉莉酸生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵因子的基因表達(dá)，暗示茉莉酸參與甘草的次生代謝和抗旱適應(yīng)［8］。

茉莉酸及茉莉酸甲酯（methy jasmonate，MeJA）是參與植物抗逆特別是抗蟲脅迫的植物激素，外施到植物體可以調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的積累［9-10］。我們?cè)谇捌谘芯炕A(chǔ)上研究不同濃度MeJA處理對(duì)甘草根有效成分甘草酸和甘草苷的積累，以及MeJA對(duì)甘草有效成分生物合成途徑關(guān)鍵酶β-香樹脂醇合酶（β-amyrin synthase，GubAS）［11］、β- 香樹脂醇 -11- 氧化酶（β-amyrin 11-oxidase，GubAO）［12］和 6-脫氧查爾酮合酶（6' -deoxychalcone synthase，GuDOCS）［13］基因表達(dá)的影響，探討MeJA對(duì)甘草根次生代謝的調(diào)控及其分子機(jī)制。研究結(jié)果有助于揭示甘草在干旱環(huán)境中通過茉莉酸調(diào)控有效成分積累的機(jī)制，同時(shí)為應(yīng)用化學(xué)調(diào)控提高甘草品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘草種子采自內(nèi)蒙古杭錦旗4年生甘草，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利老師鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的種子。種子萌發(fā)后，將幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)土∶沙子∶土壤=2∶2∶1（體積比）的花盆中，按常規(guī)方法栽培。

茉莉酸甲酯（美國(guó)Sigma公司）；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根公司）；PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus，大連寶生物工程有限公司）；CFX96熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MeJA處理甘草 甘草栽培6個(gè)月后，用20、50、100 μmol/L的MeJA溶液噴施葉片，0、2、6、12、24、36、72 h后取部分甘草根快速洗凈后用液氮速凍，-80℃保存，用于基因表達(dá)水平測(cè)定。剩余甘草每3 d噴施一次MeJA溶液，連續(xù)處理3次，藥后9 d取根和根莖陰干，用于甘草根有效成分含量測(cè)定。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2 甘草酸和甘草苷含量測(cè)定 取甘草干燥樣品，粉碎后過三號(hào)篩，精密稱定0.2 g加入100 mL 70 %乙醇，稱定重量，超聲提取30 min后補(bǔ)足重量，過濾取濾液作為供試品溶液。參照《中國(guó)藥典》采用高效液相色譜法測(cè)定甘草酸和甘草苷含量［1］。

1.2.3 基因表達(dá)量測(cè)定 （1）甘草根總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 將MeJA溶液處理0、2、6、12、24、36、72 h的甘草根使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒，參照說明書的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA。

（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR） 根據(jù)本課題組甘草根轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的GubAS、GubAO、GuDOCS基因序列［10］設(shè)計(jì)引物（表1）。采用 SYBR Premix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）試劑盒和CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR。PCR 擴(kuò)增程序：95℃，30 s；95℃，5s；58℃，30 s；39個(gè)循環(huán)。以管家基因β-Tubulin的表達(dá)量作參照，采用2﹣△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA對(duì)甘草根中甘草酸和甘草苷積累的調(diào)控

由圖1可知，MeJA溶液處理甘草根對(duì)其有效成分甘草酸含量有顯著效果，特別是濃度為20、50 μmol/L MeJA溶液處理的甘草酸濃度與對(duì)照相比有極顯著提高。20 μmol/L MeJA溶液對(duì)甘草苷的含量沒有顯著影響，高濃度MeJA溶液處理下甘草苷含量顯著降低。

圖1 MeJA濃度對(duì)甘草根有效成分積累的影響

2.2 MeJA對(duì)甘草根次生代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的調(diào)控

2.2.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 圖2為目的基因GubAS、GubAO、GuDOCS和內(nèi)參基因β-Tubulin標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中擴(kuò)增效率與相關(guān)系數(shù)見表2。在檢測(cè)樣品5個(gè)濃度梯度中，擴(kuò)增效率結(jié)果表明內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率都在90%～105%范圍。相關(guān)系數(shù)大于0.98表明Ct值與起始模板稀釋倍數(shù)的相關(guān)性良好，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率符合2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的條件。

表2 目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)

2.2.2 甘草根次生代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平 從GubAS基因表達(dá)量的變化（圖3 A）可知，20 μmol/L MeJA溶液處理0～6 h與50 μmol/L MeJA溶液處理0～2 h均對(duì)甘草根GubAS基因表達(dá)有不同程度的促進(jìn)作用，其中20 μmol/L MeJA溶液處理6 h的甘草中，GubAS基因表達(dá)量與起始表達(dá)量相比有極顯著提高，且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，中低濃度的MeJA處理組中GubAS基因表達(dá)逐漸恢復(fù)處理前水平；100 μmol/L MeJA溶液對(duì)GubAS基因表達(dá)沒有顯著作用。

對(duì)于GubAO基因（圖3B），20 μmol/L MeJA溶液處理0～6 h與50 μmol/L MeJA溶液處理0～2 h均促進(jìn)其表達(dá)，在20 μmol/L MeJA溶液處理6 h的甘草根中GubAO基因表達(dá)量得到極顯著提高，隨后逐漸恢復(fù)至處理前水平；100 μmol/L MeJA溶液處理下GubAO基因與起始表達(dá)量相比無顯著性差異。

圖2 目的基因GubAS（A）、GubAO（B）、GuDOCS（C）與內(nèi)參基因β-Tubulin（D）的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 MeJA處理濃度和時(shí)間對(duì)甘草根GubAS（A）、GubAO（B）、GuDOCS（C）基因表達(dá)的調(diào)控

由圖3C可知，20 μmol/L的MeJA溶液處理0～6 h促進(jìn)GuDOCS基因表達(dá)，其中20 μmol/L MeJA溶液誘導(dǎo)6 h的GuDOCS基因表達(dá)量得到極顯著提高；50 μmol/L MeJA溶液處理對(duì)GuDOCS基因表達(dá)沒有明顯的促進(jìn)作用，100 μmol/L MeJA溶液處理2 h后促進(jìn)甘草根中GuDOCS基因表達(dá)，24 h后出現(xiàn)抑制GuDOCS基因表達(dá)的現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，施用MeJA等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能有效提高栽培藥用植物的品質(zhì)［14-16］。外施MeJA能對(duì)植物產(chǎn)生與逆境脅迫相似的作用：激活植物體內(nèi)茉莉酸信號(hào)途徑，誘發(fā)防御基因表達(dá)，引起系統(tǒng)誘導(dǎo)型抗性［17］。在此過程中，MeJA可調(diào)節(jié)植物次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)從而促進(jìn)某些產(chǎn)物的合成和積累：Mangas［18］研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能促進(jìn)積雪草三萜類化合物的合成，但抑制植物甾醇的合成；行玉冰等［19］發(fā)現(xiàn)MeJA調(diào)節(jié)丹參代謝相關(guān)酶的表達(dá)，促進(jìn)迷迭香酸的合成；Dai等［20］研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能提高猴頭菌的生物量及麥角甾醇的含量；Liu等［21］通過對(duì)何首烏轉(zhuǎn)錄組分析表明，MeJA能顯著影響何首烏有效成分生物合成多個(gè)基因的表達(dá)。

本試驗(yàn)研究了外源MeJA對(duì)甘草根中甘草酸和甘草苷的含量及其對(duì)應(yīng)的生物合成途徑相關(guān)酶基因表達(dá)的調(diào)控作用，結(jié)果表明20、50 μmol/L MeJA溶液處理后的甘草根中甘草酸含量得到極顯著提高；同時(shí)GubAS和GubAO作為甘草酸等三萜類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵基因，在20 μmol/L MeJA溶液誘導(dǎo)中表達(dá)量存在不同程度提高，其中在該濃度下誘導(dǎo)6 h后的表達(dá)量達(dá)到極顯著提高。推斷中低濃度的MeJA溶液在處理初期對(duì)甘草酸的合成和積累具有促進(jìn)作用，隨著MeJA溶液濃度的提高與處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MeJA對(duì)甘草酸生物合成的上調(diào)作用逐漸減弱。同樣，結(jié)合MeJA溶液對(duì)甘草苷含量及其生物合成途徑中下游基因GuDOCS基因表達(dá)量的影響，分析發(fā)現(xiàn)低濃度MeJA溶液在處理初期對(duì)甘草根中GuDOCS基因的表達(dá)存在促進(jìn)作用，但未體現(xiàn)甘草苷含量的提高，且隨著MeJA濃度提高與處理時(shí)間延長(zhǎng)，甘草苷的合成與積累受到抑制，因此可初步推斷MeJA對(duì)甘草苷的作用不明顯。

植物次生代謝途徑及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，本研究發(fā)現(xiàn)外源MeJA通過調(diào)控甘草有效成分生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)不同有效成分的合成和積累有不同的調(diào)控效果，更深入的調(diào)控機(jī)制仍需后續(xù)研究。本研究為化學(xué)調(diào)控提高栽培甘草的品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，也為甘草資源的保護(hù)與可持續(xù)利用提供可行的途徑。

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（責(zé)任編輯 白雪娜）

Regulation of methyl jasmonate on secondary metabolism of Glycyrrhiza uralensis root

LIANG Xiao-wei，YANG Quan，LI Dan，CHENG Xuan-xuan，TANG Xiao-min，PAN Li-ming，ZHANG Chun-rong
（School of Traditional Chinese Medicines，Guangdong Pharmaceutical University/Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Production& Development of Cantonese Medicinal Materials，Guangzhou 510006，China；

R932

A

1004-874X（2017）06-0057-06

梁曉薇，楊全，李丹，等.茉莉酸甲酯對(duì)甘草根次生代謝的調(diào)控［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（6）：57-62.

2016-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（811173488）；中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（201207002）；中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所項(xiàng)目（2011ZDXK-01）；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研項(xiàng)目（20142090）

梁曉薇（1991-），女，碩士，E-mail：1329509951@qq.com

張春榮（1976-），男，博士，講師，E-mail：zhangchunr@21cn.com