核磁共振法測定西洛他唑含量

楊金霞，姚婷玉，王健偉，張丹

(蘇州高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)服務(wù)中心生物醫(yī)藥分析測試中心，江蘇蘇州 215011)

核磁共振法測定西洛他唑含量

楊金霞，姚婷玉，王健偉，張丹

(蘇州高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)服務(wù)中心生物醫(yī)藥分析測試中心，江蘇蘇州 215011)

建立核磁共振（1H NMR）法測定西洛他唑含量的方法。采用Bruker Avance Ⅲ400 MHz核磁共振波譜儀，以1，2，4，5-四氯-3-硝基苯為內(nèi)標(biāo)，氘代氯仿為溶劑，zg30脈沖序列。對實驗參數(shù)如掃描次數(shù)、延遲時間等進行優(yōu)化。西洛他唑質(zhì)量在5～30 mg范圍內(nèi)，樣品和內(nèi)標(biāo)物的積分面積比值與樣品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.995 3，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.4%（n=5)。該方法可用于藥品的質(zhì)量控制和監(jiān)管。

核磁共振法；西洛他唑；含量

西洛他唑（cilostazol）臨床上主要用于改善慢性動脈閉塞癥引起的缺血性癥狀，如潰瘍、肢痛、發(fā)冷及間歇性跛行［1］。經(jīng)查閱相關(guān)文獻及國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［2，3］，目前測定西洛他唑的方法有高效液相色譜法（HPLC），該法以甲醇-水為流動相，定量檢測需要對照品，且檢測時間較長。中國藥典2010年二部附錄Ⅸ［4］首次引入核磁共振波譜法，但沒有具體品種藥物的NMR定量方法。隨著現(xiàn)代儀器靈敏度的不斷提高，NMR定量法測定藥物含量將成為今后發(fā)展的趨勢［5，6］。

筆者采用1H NMR法測定西洛他唑含量，通過對西洛他唑結(jié)構(gòu)(圖1)分析，選擇西洛他唑結(jié)構(gòu)中5，7，8三個氫的吸收為特征峰，用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品1，2，4，5-四氯-3-硝基苯中1個氫為定量內(nèi)標(biāo)，根據(jù)核磁信號強度與質(zhì)子數(shù)目成正比的特點對藥物進行定量分析［4］。該法簡便、專屬性較強，不需要西洛他唑?qū)φ掌?，對樣品無破壞，準(zhǔn)確性、重復(fù)性較好。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

核磁共振波譜儀：Bruker Avance Ⅲ400 MHz型，瑞士Bruker公司；

圖1 西洛他唑化學(xué)結(jié)構(gòu)式

BBO探頭：5 mm；

核磁管：內(nèi)徑5 mm；

電子天平：XS205，d=0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

溶劑：CDCl3，氘代度 99.8%+0.03%TMS，美國CIL公司；

定量內(nèi)標(biāo)：1，2，4，5-四氯-3-硝基苯，批號421-7A，純度99.3%，美國Chem Service 公司；

西洛他唑原料：蘇州中化藥品工業(yè)有限公司。

1.2 實驗條件

采用zg30脈沖序列［7］；測定溫度（探頭溫度）：300 K；溶劑：CDCl3；采樣次數(shù)（NS）：8，TD=65 536；譜寬：8 012.82 Hz；脈沖寬度（P1）：10.60 μs；脈沖功率（PL1）：-2.00 dB；脈沖延遲時間（d1）：15 s；采樣時間（AQ）：4.0 894 966 s。

1.3 實驗方法

精密稱取西洛他唑30 mg和1，2，4，5-四氯-3-硝基苯10 mg置于直徑5 mm的核磁管中，加入1.0 mL CDCl3使其完全溶解，蓋上管帽，按1.2實驗條件進行氫譜檢測，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，勻場，采樣，圖譜處理，確定結(jié)構(gòu)無誤后，選擇西洛他唑的特征峰（7.6≤δ≤ 7.8）和 1，2，4，5-四氯-3-硝基苯的單峰（6.6≤δ≤6.8）作為定量分析的特征峰，將其積分，取5次測定結(jié)果的平均值，按1.4中公式計算西洛他唑的含量。

1.4 結(jié)果計算

西洛他唑含量按下式計算：

式中：CS——待測樣品的含量；

mR——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量，mg；

AS，AR——樣品和內(nèi)標(biāo)物的定量特征峰積分面積；

ES，ER——樣品和內(nèi)標(biāo)物的定量特征峰質(zhì)子當(dāng)量質(zhì)量（以分子量除以定量特征峰對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)），Da；

CR——內(nèi)標(biāo)物的含量；

ms——樣品質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑的選擇

當(dāng)選擇CDCl3為溶劑時，樣品和內(nèi)標(biāo)物能夠完全溶解，且溶劑峰（δ=7.72）與樣品的定量特征峰（δ=6.70）完全分離，不相互干擾，測定結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇CDCl3為溶劑。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

試驗發(fā)現(xiàn)，1，2，4，5-四氯-3-硝基苯只有一個特征參考峰（δ=7.74）與樣品西洛他唑的特征峰（δ=6.70）完全分離，而且這兩組峰與其它峰也能完全分開，峰兩側(cè)的基線平坦，其積分值比較準(zhǔn)確，可作為定量分析的依據(jù)。因此選擇1，2，4，5-四氯-3-硝基苯為定量內(nèi)標(biāo)物。

2.3 樣品量的選擇

配制不同濃度的樣品進行分析，試驗結(jié)果顯示，樣品最低濃度為0.01 mol／L即可滿足檢測要求。

2.4 延遲時間d1的選擇

當(dāng)d1≥5×T1（T1為縱向弛豫時間）才能保證在下次掃描時磁化矢量完全回到Z軸，否則對結(jié)果的影響較大。分別設(shè)置 d1=1，2，4，6，8，10，15，20，25 s ，進行試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，d1≤15 s時，隨著d1的增加，樣品和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值逐漸增大；d1＞15 s時，樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值沒有明顯變化，因此d1選擇15 s。

2.5 掃描次數(shù)NS的選擇

將掃描次數(shù) NS 設(shè)定為 4，8，16，32，64，128，對樣品分別進行試驗，結(jié)果表明，掃描次數(shù)改變，樣品和內(nèi)標(biāo)物積分面積的比值沒有明顯變化，因此選擇NS=8。

2.6 工作曲線

精密稱取內(nèi)標(biāo)物24.8 mg ，置于5 mL容量瓶中，加適量CDCl3充分振搖使其完全溶解，用溶劑CDCl3定容至刻度，作為內(nèi)標(biāo)溶液；精密稱取西洛他唑 5.4，10.4，15.2，20.1，25.3，30.0 mg 分別加入到核磁管中，各加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，使其完全溶解后，按1.2實驗條件進行氫譜檢測，對樣品和內(nèi)標(biāo)物的特征峰分別積分，每個濃度樣品的積分面積取3次測定結(jié)果的平均值，結(jié)果見表1。

表1 樣品與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及其特征峰面積

利用樣品和內(nèi)標(biāo)物積分面積的比值（y）對樣品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量的比值（x）進行線性回歸，回歸方程為y=2.406 1x-0.523 6，相關(guān)系數(shù)r=0.995 9，線性范圍為 5.0～30.0 mg。

2.7 重復(fù)性試驗

按1.2實驗條件對批號為X21-002，X21-003樣品溶液（編號為1#，2#）進行測定，每個樣品重復(fù)測定5次，計算樣品和內(nèi)標(biāo)物的特征峰面積的比值，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.12%，0.31%，由此可見方法的重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗

將批號為X21-003的樣品溶液在室溫下分別放置 0，2，4，6，8，10，12，24 h 后進行測定，計算樣品和內(nèi)標(biāo)物特征峰面積的比值，8次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.36%，表明樣品在24 h內(nèi)放置穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.9 樣品測定

取3批西洛他唑樣品分別用本法和標(biāo)準(zhǔn)方法（HPLC法）進行檢測，測定結(jié)果見表4。由表4可知，核磁共振法與標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果相符合。以1#樣品為例，樣品、內(nèi)標(biāo)物及溶劑的1H NMR譜圖見圖2。

表4 樣品測定結(jié)果

圖2 樣品、內(nèi)標(biāo)物及溶劑的1H NMR譜圖

2.10 其它影響因素

（1）為保證NMR定量結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，圖譜的處理很關(guān)鍵：首先要保證勻場要好，否則會造成半峰寬的加寬和峰型的變化，影響積分面積。勻場好壞的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：氘代試劑中的內(nèi)標(biāo)物TMS除了出現(xiàn)尖銳的單峰外，在其峰的底部兩側(cè)各有一個小峰。相位調(diào)整要仔細(xì)，應(yīng)將譜圖放大后調(diào)整峰形左、右輪廓線與水平的基線剛好重合，積分面積的起、止點每次要一致，基線要平直，并對該組峰面積的積分取5次測定結(jié)果的平均值，以減少誤差。

（2）為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性可以再選擇樣品的另一組信號峰以同樣的方法進行定量，然后以這兩組峰測量結(jié)果的平均值作為含量測定的結(jié)果,這樣更接近藥品含量的真實結(jié)果。

3 結(jié)語

采用NMR法測定西洛他唑藥品含量，測定結(jié)果的重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好，該方法具有快速、準(zhǔn)確、簡單的特點。在被測樣品沒有高純度對照品或難以得到對照品的情況下，可以作為藥品含量測定的補充，在含量檢測的同時，對其結(jié)構(gòu)進行確證（即藥物鑒定），這對防止假冒、偽劣藥品的出現(xiàn)具有極其重要的意義。

［1］Kambayashi J，Liu Y G，Sun B，et al. Ciloslazol as a unique antithrombotic agent ［J］. Curr Pharm Des 2003，9(28)：2 281-2 291.

［2］王存芳，嚴(yán)啟新，李勇.HPLC法測定西洛他唑含量［J］.中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2006(1)： 21-22.

［3］YBH 05382004 西洛他唑［S］.

［4］國家藥典委員會.中國藥典［M］.二部：附錄.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［5］孫靜霞，張正行.NMR在藥物定量分析中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2005，25(1)： 117-122.

［6］于小波，沈文斌，相秉仁.定量核磁共振技術(shù)及其在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進展［J］.藥學(xué)進展，2010，34(1)： 17-24.

［7］張友杰，劉小鵬.藥物核磁共振定量分析參數(shù)研究［J］.波譜學(xué)雜志，2007，24(3)： 289-295.

Determination of Cilostazol by1H NMR

Yang Jinxia, Yao Tingyu, Wang Jianwei, Zhang Dan
（Analytical and Testing Center of Bio-Medicine in Suzhou New & High-Tech Innovation Service Center，Suzhou 215011， China ）

A method for the determination of cilostazol by1H NMR was established. Proton nuclearmagnetic resonance spectroscopy(1H NMR) spectra were obtained in CDCl3with the internal standard 1，2，4，5-tetr-achloro-3-nitrobenzene and zg30 pulse sequence by using Bruker AvanceⅢ400 MHz spectrometer. Testing parameters such as scanning number，delay time were optimized. Area ratio of sample and internal standard was linear with mass ratio of sample and internal standard in the range of 5.0-30 mg for cilostazol concentration,r=0.995 3. The relative standard deviation of detection results was less than 0.4%(n=5). This method is suitable for quality control and supervision.

NMR; cilostazol; content

O 657.2

A

1008-6145(2012)04-0068-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2012.04.021

聯(lián)系人：楊金霞；E-mail： yjx@csibi.cn

2012-04-17