NPM1基因在急性髓細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其臨床意義

李 明，湯愛萍，余 莉，李慧慧，費(fèi) 妍

(1.江西省宜春市人民醫(yī)院血液內(nèi)科 336000;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南昌 330006)

近年來發(fā)現(xiàn)，大約46%～62%的急性髓細(xì)胞白血病(AML)中存在NPM1第12號外顯子的突變，其在血液腫瘤發(fā)生中具有始動作用[1]。鑒于突變檢測方法復(fù)雜，費(fèi)用高昂，臨床應(yīng)用受到一定程度限制，因此探尋其基因表達(dá)量與AML的關(guān)系正成為研究的熱點(diǎn)，本研究從基因轉(zhuǎn)錄水平層面出發(fā)，探討野生型NPM1表達(dá)在AML患者預(yù)后判斷及微小殘留病(MRD)監(jiān)測的意義，旨在為AML患者提供簡便、可靠的分子學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科2010年3～9月住院的59例AML患者，所有患者診斷均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[2]。其中，男28例，女31例；中位年齡47.5歲(12～70歲)；初治38例，難治3例，復(fù)發(fā)3例；完全緩解(CR)期患者15例按FAB分型為M1 1例，M2 31例，M3 19例，M5 6例，M6 2例。同期血液科住院骨髓健康患者15例作為對照組，其中，男7例，女8例；中位年齡40歲(22～61歲)。對于部分患者連續(xù)追蹤3～4個療程以進(jìn)行基因表達(dá)的動態(tài)監(jiān)測。

1.2方法

表1 引物

1.2.1治療方案及療效標(biāo)準(zhǔn) AML采用一線化療方案；急性早幼粒細(xì)胞白血病患者采用維甲酸20 mg 2次/日誘導(dǎo)分化治療，療效判斷均按張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[2]評價。

1.2.2總RNA提取 無菌采集骨髓2～3 mL，淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓單個核細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成) 見表1。

1.2.4cDNA合成 取總RNA 2 μg，采用EasyScriptTMTwo-Step RT-PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行cDNA合成(北京全式金生物技有限公司，AE401)。

1.2.5PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系20 μL，cDNA取1 μL，上下游引物各取1 μL，2.5 U/μLTaqDNA聚合酶12.5 μL，焦碳酸二乙酸(DEPC)水7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃解鏈1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，33個循環(huán)，72 ℃延伸6 min。

1.2.6PCR產(chǎn)物分析 擴(kuò)增結(jié)束后取等量NPM1和GAPDH產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。Quantity One 4.4軟件半定量分析，取NPM1/GAPDH比值代表NPM1 mRNA表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以NPM1基因表達(dá)量的中位數(shù)作為區(qū)分NPM1表達(dá)水平高低的臨界值。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，本研究結(jié)果中NPM1表達(dá)水平為非正態(tài)分布，故計(jì)量數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，計(jì)數(shù)資料的兩樣本率或多個樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本比較采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用秩相關(guān)法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1初治AML組、難治復(fù)發(fā)組、CR組和對照組NPM1表達(dá)情況 4組NPM1陽性率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2：2.556；df：2；P：0.279)，詳見表2。

表2 不同病期AML患者NPM1陽性率比較

*：與對照組陽性率比較；-：無數(shù)據(jù)。

2.2不同病期AML患者NPM1表達(dá)水平比較 初治和難治復(fù)發(fā)組NPM1中位表達(dá)水平高于CR組及對照組(P<0.05)，難治復(fù)發(fā)組NPM1中位表達(dá)水平高于初治組(P=0.027)，見表3、4，圖1。

2.3初治AML患者NPM1表達(dá)水平與性別、年齡、外周血白細(xì)胞數(shù)、骨髓原始幼稚細(xì)胞數(shù)等臨床因素的關(guān)系 NPM1強(qiáng)度與外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓幼稚細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表3 不同病期AML患者NPM1表達(dá)水平比較

*：與對照組比較；-：無數(shù)據(jù)。

表4 初治AML患者NPM1表達(dá)水平與臨床療效的關(guān)系

*：與其他各組比較；-：無數(shù)據(jù)。

表5 初治AML患者NPM1表達(dá)水平與臨床因素之間的關(guān)系

表6 治療有效組和無效組之間NPM1表達(dá)水平比效

-：無數(shù)據(jù)。

2.4動態(tài)監(jiān)測NPM1表達(dá) 28例初治患者，1個療程化療后達(dá)CR 19例，PR 6例，NR 3例，治療后NPM1表達(dá)水平均不同程度下降，其中NPM1基因高表達(dá)患者12例，4例達(dá)CR狀態(tài)，表達(dá)水平降至中位水平以下，監(jiān)測3個療程表達(dá)水平穩(wěn)定，隨訪骨穿目前仍處于緩解狀態(tài)，1例M5患者初始NPM1表達(dá)水平為0.941 7，第1個療程達(dá)CR，監(jiān)測4個療程N(yùn)PM1表達(dá)水平不降，持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)，中位表達(dá)水平為0.828 1(0.769 1～0.941 7)，8個療程化療后一直處于CR狀態(tài)，另外7例NPM1高表達(dá)患者治療后仍持續(xù)高表達(dá)NPM1基因，為難治性白血病，其中1例一療程后NR，NPM1表達(dá)不降，后繼3個療程達(dá)CR，NPM1略高于中位表達(dá)水平，第5個療程臨床復(fù)發(fā)，再次誘導(dǎo)失敗，見表6。

1:對照組;2～9：初治AML患者。

圖1初治AML患者NPM1 mRNA表達(dá)水平

3 討 論

人NPM1基因定位于5q35[3]，編碼的蛋白為核仁磷酸化蛋白。NPM1蛋白主要定位在核仁，可通過核定位信號在核仁、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間往返，參與核質(zhì)間運(yùn)輸，NPM1在調(diào)控周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用。

通過檢測不同來源的白血病細(xì)胞中野生型NPMl基因表達(dá)水平，有研究顯示髓系來源的K562系細(xì)胞和75%白血病骨髓細(xì)胞均高表達(dá)NPMl基因[4]，國內(nèi)學(xué)者何鵬等[5]采用PCR方法分別檢測了K562細(xì)胞系、THP1細(xì)胞系、初治AML患者骨髓和健康人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的野生型NPM1基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩種白血病細(xì)胞系和5例AML患者骨髓均表達(dá)NPM1基因，且強(qiáng)度明顯高于PBMC，雖然發(fā)現(xiàn)白血病患者骨髓細(xì)胞野生型NPM1蛋白含量比健康人高出2～8倍[6-7]，但野生型NPMl基因高表達(dá)對白血病細(xì)胞的影響研究甚少，在AML中野生型NPM1的表達(dá)水平及作用機(jī)制以及對疾病的進(jìn)展、治療反應(yīng)等影響尚無定論，基于以上研究，筆者對AML患者骨髓中野生型NPM1基因的表達(dá)情況進(jìn)行了初步研究。

本研究結(jié)果顯示，野生型NPM1基因不僅在初治及難治復(fù)發(fā)患者中表達(dá)，在CR期和對照組中也存在不同程度的表達(dá)，但各組NPM1陽性率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這也與NPM1基因在健康人群中存在廣泛生理性表達(dá)相符合，需要更深入地了解不同病期AML患者和健康人NPM1基因狀態(tài)之間的差異。

筆者對各組NPM1基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示難治復(fù)發(fā)組患者NPM1中位表達(dá)水平高于初治組、CR組及對照組(P<0.05)，且初治組NPM1表達(dá)水平高于CR組和對照組，這證實(shí)了在初治AML患者骨髓中存在NPM1的高表達(dá)現(xiàn)象，而且與患者疾病狀態(tài)存在一定的聯(lián)系，對不同NPM1表達(dá)水平AML患者的療效觀察也顯示，NPM1高表達(dá)組治療有效率低于其他各組(P<0.05)，提示初發(fā)時NPM1表達(dá)水平高者對化療反應(yīng)差、CR率低，在初始治療時就可以考慮給予較強(qiáng)的化療方案或逆轉(zhuǎn)耐藥治療；而初發(fā)時NPM1水平低者或陰性患者對化療反應(yīng)好、易緩解，可給予常規(guī)方案，以減少化療帶來的不良反應(yīng)和并發(fā)癥，NPM1基因高表達(dá)可以為判斷預(yù)后的一個指標(biāo)。國外學(xué)者通過構(gòu)建實(shí)時熒光定量PCR方法檢測了96例AML患者中野生型和突變型NPM1的表達(dá)水平[8]，結(jié)果顯示突變型表達(dá)水平高于野生型表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組表達(dá)水平與對照組有顯著性差異，也進(jìn)一步證實(shí)了AML患者中存在野生型NPM1基因的異常表達(dá)現(xiàn)象。野生型NPM1基因高表達(dá)致白血病的機(jī)理仍不清楚，根據(jù)現(xiàn)有研究表明NPM1高表達(dá)主要直接或間接影響P53和可變讀框基因(ARF)通路導(dǎo)致白血病的發(fā)生。Bard等[9]通過向淋巴母細(xì)胞(FA-C)中轉(zhuǎn)染NPM1表達(dá)載體提高NPM1表達(dá)水平后，可以使PKR激酶活性顯著降低，使細(xì)胞凋亡數(shù)目減少60%，這說明NPM1表達(dá)強(qiáng)度的增加可能是FA-C轉(zhuǎn)化成白血病細(xì)胞的機(jī)制之一。最近的研究還顯示[10]，將NPM1過表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，這些細(xì)胞表現(xiàn)出了很強(qiáng)的生長能力和腫瘤生成能力，而且這些細(xì)胞中干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)的靶基因賴氨酸氧化酶基因表達(dá)水平下降，提示NPM1過表達(dá)抑制了IRF-1的抗腫瘤作用，以上結(jié)合本研究結(jié)果提示NPM1表達(dá)增強(qiáng)參與了AML的發(fā)生和發(fā)展過程，但另一方面值得關(guān)注的是，個別研究結(jié)果也顯示[11]當(dāng)細(xì)胞在出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)或DNA損傷時，細(xì)胞內(nèi)NPM1表達(dá)水平可增加，能夠通過增加P53的穩(wěn)定性而抑制細(xì)胞的增殖并引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，NPM1基因改變對細(xì)胞增殖和凋亡的影響及在AML中的作用還需要進(jìn)一步深入研究。

本研究也初步探討了野生型NPM1基因在AML中MRD檢測和應(yīng)用的可行性。依據(jù)本研究的結(jié)果表明，NPM1表達(dá)強(qiáng)度與外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓原始幼稚細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，雖然動態(tài)觀察結(jié)果例數(shù)有限，但可以看出，NPM1高表達(dá)不降者，除預(yù)后差外，而且更易復(fù)發(fā)，因此，定量分析NPM1基因可以作為MRD的監(jiān)測指標(biāo)，但值得注意的是本研究觀察到1例AML-M5患者，初診時NPM1高表達(dá)，第1個療程達(dá)CR，NPM1基因表達(dá)水平不降，連續(xù)追蹤4個療程N(yùn)PM1表達(dá)水平始終穩(wěn)定在高水平，該患者已完成8個療程以上化療，一直處于臨床緩解狀態(tài)，該患者是否存在合并NPM1基因突變可能，野生型NPM1表達(dá)與NPM1突變有何種關(guān)系尚不清楚，這些都有待進(jìn)一步研究，因此NPM1高表達(dá)作為MRD的監(jiān)測指標(biāo)仍應(yīng)慎重，有待在臨床實(shí)踐中進(jìn)一步觀察和總結(jié)?？傊?，AML患者中存在NPM1基因的異常表達(dá)現(xiàn)象，NPM1異常表達(dá)與AML的發(fā)生及發(fā)病有關(guān)，其定量分析NPM1基因表達(dá)可以作為預(yù)后危險分層和白血病微小殘留病灶監(jiān)測的指標(biāo)之一。

[1]Wertheim G,Bagg A.Nucleophosmin (NPM1) mutations in acute myeloid leukemia:an ongoing(cytoplasmic) tale of dueling mutations and duality of molecular genetic testing methodologies[J].J Mol Diagn,2008,10(3):198-202.

[2]張之南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京：科學(xué)出版社，2007：106-112.

[3]Grisendi S,Pandiolfi PP.NPM mutation in acute myelogenous leukemia[J].N Engl J Med,2005,352(3):291-292.

[4]Lindstr?m MS,Zhang Y.Ribosomal protein S9 is a novel B23 /NPM-binding protein required for normal cell proliferation[J].J Biol Chem,2008,283(23):15568-15576.

[5]何鵬,駱展鵬,張伶，等.RNAi重組體抑制白血病K562細(xì)胞系中NPM1基因的表達(dá)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2008,30(10)：983-941.

[6]Chan PK,Chan FY,Morris SW,et al.Isolation and characterization of the human nucleoposmin/B23(NPM) gene:identification of the YY1 binding site at the 5′enhancer region[J].Nucleic Acids Res,1997,25(6):1225-1232.

[7]Qing Y,Yingmao G,Lujun B,et al.Role

of Npm1 in proliferation,apoptosis and differentiation of neural stem cell[J].J Neurol Sci,2008,266(2):131-137.

[8]Hafez M,Ye F,Jackson K,et al.Performance and clinical evaluation of a sensitive multiplex assay for the rapid detection of common NPM1 mutation[J].J Mol Diagn,2010,12(5):629-635.

[9]Bard JD,Gelebart P,Anand M,et al.Aberrant expression of IL-22 receptor 1 and autocrine IL-22 stimulation contribute to tumorigenicity in ALK+anaplastic large cell lymphoma[J].Leukemia,2008,22(8):1595-1603.

[10]Greulich C,Diendorf J,Gessmann J,et al.Cell type-specific responses of peripheral blood mononuclear cells to silver nanoparticles[J].Acta Biomater,2011,7(9):3505-3514.

[11]Chi HT,Vu HA,Iwasaki R,et al.Detection of exon 12 type A mutation of NPM1 gene in IMS-M2 cell line[J].Leuk Res,2010,34(2):261-262.