遠(yuǎn)志等中藥對(duì)腦淀粉樣血管病相關(guān)蛋白胱抑素聚集的影響*

何劍為，馬婧思，于東潤(rùn)，張 朔，鄒志遠(yuǎn)，宋有濤,2△

(遼寧大學(xué)：1.生命科學(xué)院;2.環(huán)境學(xué)院,沈陽(yáng) 110036)

腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy,CAA) 是一種常發(fā)生于老年人的微血管疾病，臨床以血管壁彈力下降，最終引起顱內(nèi)反復(fù)出血為主要表現(xiàn)，病理特征為在腦小血管的內(nèi)壁出現(xiàn)嚴(yán)重的淀粉樣蛋白沉積[1]。引發(fā)CAA的重要原因之一就是編碼人胱抑素C(human cystatin C，HCC)的基因發(fā)生突變(L68Q)，改變了蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步形成類淀粉樣纖維沉淀而導(dǎo)致疾病。HCC突變體L68Q在致病機(jī)制上與引發(fā)瘋牛病、老年癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病的病原蛋白相似，即通過(guò)蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變，發(fā)生分子間交聯(lián)形成二聚體，進(jìn)一步形成類淀粉樣纖維沉淀而導(dǎo)致疾病[2]。目前對(duì)于這些蛋白質(zhì)淀粉樣沉積疾病尚無(wú)有效的治療手段。

近年來(lái)，國(guó)外研究團(tuán)隊(duì)在多種淀粉樣疾病的研究中篩選到一些具有抑制病原蛋白聚集的天然藥物化學(xué)組成成分，如芳香性生物堿菲啶和菲啶類衍生物具有明顯的抗朊病毒聚集作用[3]，多酚類物質(zhì)沒(méi)食子兒茶素和沒(méi)食子酸酯具有一定的抗朊病毒和阿爾茨海默病的治療效果[4]。另一方面，國(guó)內(nèi)王學(xué)美[5]也報(bào)道了補(bǔ)腎類中藥對(duì)早發(fā)性老年癡呆癥具有一定的功效。迄今為止，發(fā)現(xiàn)的可以治療這兩種淀粉樣蛋白病的中藥配方包括菖蒲、遠(yuǎn)志、人參、甘草、黃芪、柑桔、半夏、天麻、日本芎草窮、紅牡丹、棗、地黃、枸杞果實(shí)、當(dāng)歸、肉蓯蓉、巴戟天、烏頭、薯蕷、茯苓、銀杏、川芎、絞股藍(lán)、五味子、煙草、蛇床、芍藥、吳茱萸、姜黃、首烏、三七、大黃等[6-7]。然而，有關(guān)中藥對(duì)由胱抑素蛋白聚集引起的腦淀粉樣血管病影響的研究目前國(guó)內(nèi)、外尚無(wú)報(bào)道。此外，以上研究主要局限在臨床的治療效果上，中藥對(duì)于淀粉樣蛋白聚集的影響迄今也鮮有報(bào)道，這也成為中藥臨床使用的相關(guān)藥理學(xué)研究方面的一大缺陷。

因此，本研究利用分子生物學(xué)結(jié)合生物化學(xué)的方法，用畢赤酵母中表達(dá)的重組雞胱抑素(chicken cystatin，cC)突變體I66Q作為模型，選取銀杏葉、大黃、煙草、五味子、當(dāng)歸、甘草、川穹、茯苓、絞股藍(lán)、吳茱萸、蛇床、姜黃、首烏、芍藥、遠(yuǎn)志和三七等18種中藥材作為研究材料，采取向畢赤酵母培養(yǎng)基中直接添加中藥生藥并滅菌處理的方式(該處理方法與中藥的清蒸炮制方法相似)，通過(guò)研究中藥對(duì)胱抑素聚集特性的影響，以期篩選出具有抑制胱抑素淀粉樣聚集的藥物。這對(duì)于尋找由HCC引起的CAA的治療藥物及為中藥治療蛋白淀粉樣聚集疾病的藥理學(xué)研究具有重要的推動(dòng)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 轉(zhuǎn)入pPICZαA-cC-I66Q質(zhì)粒的酵母菌株P(guān)ichiapastorisX-33；畢赤酵母購(gòu)自Invitroge公司，胱抑素酵母表達(dá)菌株為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2培養(yǎng)基 YPD(yeast extract peptone dextrose medium)：蛋白胨2%,酵母浸粉1%,葡萄糖2%，YPD固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂粉，在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。液體培養(yǎng)基室溫保存，蛋白胨、酵母浸粉，葡萄糖均購(gòu)自上海奧博星生物科技有限公司。YPM(buffered yeast extract peptone medium)：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，在121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。加入0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。

1.1.3中藥生藥 銀杏、川芎、甘草、當(dāng)歸、絞股藍(lán)、五味子、煙草、蛇床、芍藥、吳茱萸、姜黃、遠(yuǎn)志、茯苓、首烏、三七、大黃等均購(gòu)于沈陽(yáng)市東北大藥房，兩面針購(gòu)于安徽省亳州市真源堂藥業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1胱抑素的誘導(dǎo)表達(dá)及收集 畢赤酵母在5 mL YPD培養(yǎng)基中小量培養(yǎng)12 h，200 mL YPD培養(yǎng)基中30 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)24 h至OD為3.8～4.2，4 ℃ 5 000 g離心10 min收集菌體，轉(zhuǎn)入加有濃度為500 μg/mL的不同中藥原料的100 mL YPM培養(yǎng)基中[8]，調(diào)整各培養(yǎng)液OD值在1.6～1.8之間，誘導(dǎo)表達(dá)3 d,毎24 h補(bǔ)加1次甲醇。中藥按500 μg/mL直接加到Y(jié)PM培養(yǎng)基中，滅菌。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束，4 ℃ 5 000 g離心10 min除去菌體，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.2十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè) SDS電泳實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[9]。結(jié)果用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng) DolpHin-DOC進(jìn)行掃描、分析。電泳儀購(gòu)自BIO-RAD 公司，DolpHin-DOC凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Wealtec公司。

1.2.3微生物血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法 把菌體在加有濃度為500 μg/mL不同中藥的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。取稀釋到100倍的菌液，從蓋片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，本實(shí)驗(yàn)用的是25×16計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)4個(gè)角上中方格的菌數(shù)和中央中格的菌數(shù)，之后用公式計(jì)算。

1.2.4破碎細(xì)胞 將24、48、72 h誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體4 ℃ 4 000 g離心10 min收集，試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.5Western blotting[9]將提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，恒壓100V，50 min。5%脫脂奶粉液封膜1 h，一抗兔抗cC(實(shí)驗(yàn)室自制)采用1∶2 000稀釋，緩和震蕩1 h，二抗羊抗兔IgG采用1∶5 000稀釋，緩和震蕩1 h，顯影。顯影用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑購(gòu)自碧云天生物有限公司，兔抗IgG抗體及兔抗綿羊IgG二抗購(gòu)自金斯特生物科技有限公司。

2 結(jié) 果

2.1初篩18種中藥對(duì)胱抑素聚集的影響 本實(shí)驗(yàn)用鹽析結(jié)合SDS-PAGE的方法檢測(cè)中藥對(duì)于胞外分泌cC蛋白聚集情況的作用效果。10%硫酸銨鹽析所得為胱抑素不溶物及多聚體部分，45%鹽析為寡聚體部分，60%鹽析為單倍體部分[9]。藥物篩選的結(jié)果大致分為3種情況：(1)蛋白多聚體和寡聚體的含量較未加中藥的胱抑素突變體I66Q樣品(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組)明顯減少的：遠(yuǎn)志、芍藥、姜黃、吳茱萸、大黃；(2)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的多聚體和寡聚體的蛋白含量相差不顯著的：蛇床、甘草、三七、茯苓、銀杏、絞股藍(lán)、首烏、五味子、川芎、煙草；(3)實(shí)驗(yàn)組多聚體和寡聚體的蛋白含量明顯較對(duì)照組多的：兩面針、當(dāng)歸。圖1具體顯示了其中代表性的中藥(如遠(yuǎn)志、三七和當(dāng)歸)的作用效果，結(jié)果表明遠(yuǎn)志對(duì)于胱抑素生成多聚體和寡聚體有明顯的抑制作用。此外，對(duì)于加藥后的菌液用微生物血細(xì)胞計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明除了煙草和芍藥對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用之外，其他中藥對(duì)細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著的影響，見(jiàn)表1。

2.2遠(yuǎn)志對(duì)胱抑素聚集影響的劑量效應(yīng) 為了研究不同濃度遠(yuǎn)志對(duì)胱抑素聚集的影響，筆者檢測(cè)了100、250、500、1 000、5 000 μg/mL的遠(yuǎn)志對(duì)胱抑素單倍體、寡聚體和多聚體形成的影響。如圖2所示，遠(yuǎn)志的濃度在500 μg/mL以下時(shí)，藥物劑量與抑制胱抑素聚集效果呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性；而遠(yuǎn)志的濃度大于500 μg/mL時(shí)，雖然單倍體含量有一定程度的下降，但寡聚體含量呈逐漸上升的趨勢(shì)，表明藥物劑量與抑制胱抑素聚集效果呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。這說(shuō)明遠(yuǎn)志抑制胱抑素聚集的最佳濃度為500 μg/mL。

表1 初篩18種中藥對(duì)胱抑素聚集的影響

A:10%鹽析后SDS-PAGE的結(jié)果；B:45%鹽析后SDS-PAGE的結(jié)果；C:60%鹽析后SDS-PAGE的結(jié)果；D:基于以上SDS-PAGE結(jié)果，應(yīng)用密度梯度檢測(cè)儀檢測(cè)培養(yǎng)液中的不同組分含量。

圖1遠(yuǎn)志、三七和當(dāng)歸對(duì)cC蛋白突變體I66Q聚集的影響

2.3遠(yuǎn)志對(duì)胱抑素胞內(nèi)聚集的影響 為了全面地分析遠(yuǎn)志對(duì)胱抑素聚集的作用效果，筆者利用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western blotting)檢測(cè)了遠(yuǎn)志對(duì)細(xì)胞內(nèi)胱抑素聚集的影響。加有遠(yuǎn)志的酵母細(xì)胞內(nèi)胱抑素的單倍體、二倍體的比例與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯區(qū)別。這說(shuō)明遠(yuǎn)志可能直接作用于分泌到細(xì)胞外的胱抑素，而對(duì)于胞內(nèi)的蛋白沒(méi)有作用。由于相對(duì)分子質(zhì)量大小的原因，中藥成分可能較難進(jìn)入由溶酶體等亞細(xì)胞器形成的胞內(nèi)區(qū)間[10]，見(jiàn)圖3。

A：10%鹽析后SDS-PAGE的結(jié)果；B：45%鹽析后SDS-PAGE的結(jié)果；C：60%鹽析后SDS-PAGE的結(jié)果；D：基于SDS-PAGE結(jié)果，應(yīng)用密度梯度檢測(cè)儀檢測(cè)培養(yǎng)液中的不同組分含量。

圖2不同濃度的遠(yuǎn)志對(duì)胱抑素聚集的影響

圖3 Western blotting分析胞內(nèi)水平遠(yuǎn)志對(duì)cC蛋白聚集的影響

3 討 論

HCC由于在生理?xiàng)l件下也非常容易聚集，且大部分形成二聚體[11]，這為該領(lǐng)域的研究帶來(lái)了諸多困難。在其替代模型尋找過(guò)程中研究者發(fā)現(xiàn)，cC與HCC同屬于Cystatin超家族Ⅱ型，二者具有高度同源性[12]。cC與HCC相比有更高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，與HCC易于形成二聚體不同，cC在生理?xiàng)l件下主要以單體形式存在[13]，這為相關(guān)蛋白質(zhì)生化實(shí)驗(yàn)提供了便利可操作的優(yōu)勢(shì)，也成為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的藥物篩選模型的理論基礎(chǔ)。

本研究利用畢赤酵母表達(dá)的cC的突變體I66Q菌株，采用SDS-PAGE結(jié)合密度梯度蛋白測(cè)定技術(shù)以及免疫印跡法在胞內(nèi)和胞外定量分析了多種單方中藥對(duì)cC突變體I66Q的聚集的影響。研究結(jié)果表明，遠(yuǎn)志、芍藥、姜黃、吳茱萸、大黃在胞外水平上對(duì)cC突變體I66Q的聚集有明顯的抑制作用,而遠(yuǎn)志的作用最為明顯，接下來(lái)更深一步地研究遠(yuǎn)志對(duì)cC突變體I66Q的聚集情況的影響，通過(guò)劑量效應(yīng)分析顯示，遠(yuǎn)志對(duì)cC淀粉樣聚集的抑制濃度區(qū)間為小于等于500 μg/mL，在高于此濃度時(shí)，遠(yuǎn)志的劑量與cC淀粉樣聚集呈負(fù)相關(guān)。

本研究所使用的表達(dá)體系為基于畢赤酵母的外源蛋白表達(dá)體系，由于在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)將cC的cDNA直接與前端的畢赤酵母自身的分泌信號(hào)肽序列連接，因此經(jīng)翻譯、折疊、修飾的外源蛋白直接分泌至胞外，畢赤酵母的自身蛋白分泌量極小，加上畢赤酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基中只有少量的蛋白[14]，這意味著分泌的外源蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要組成成分，可作為蛋白純化的第一步，因此，在研究中采取的在培養(yǎng)基中直接加入的中藥成分應(yīng)主要作用于外源分泌蛋白，即cC的單體及二聚體。由HCC引起的CCA的致病原因是由于HCC的突變體L68Q通過(guò)結(jié)構(gòu)域交換形成二聚體，二聚體進(jìn)一步聚集在血管內(nèi)形成淀粉樣纖維沉淀，進(jìn)而引發(fā)CCA，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞適量濃度的遠(yuǎn)志在一定程度上能有效抑制cC的二聚體及多聚體的形成，由此可以推測(cè)，有抑制寡聚體形成的中藥成分將可作為潛在的HCC關(guān)聯(lián)CCA的候選治療藥物。

基于HCC的一級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，HCC在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的絕大部分為分泌蛋白，少部分存留于細(xì)胞區(qū)間的溶酶體系統(tǒng)，為深入分析中藥成分對(duì)胱抑素的聚集影響，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞裂解，應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)了遠(yuǎn)志對(duì)胞內(nèi)HCC的影響，結(jié)果顯示在胞內(nèi)水平上并沒(méi)有明顯的影響，提示由于相對(duì)分子量大小的原因，中藥成分可能較難進(jìn)入由溶酶體等亞細(xì)胞器形成的胞內(nèi)區(qū)間。

對(duì)中藥成分抑制HCC寡聚體形成的深入研究將有助于理解小分子化合物抑制淀粉樣聚集的抑制機(jī)制，從而有利于開(kāi)發(fā)出潛在的基于中草藥物的HCC關(guān)聯(lián)CCA的新療法。

[1]Palsdottir A,Snorradottir AO,Thorsteinsson L.Hereditary cystatin C amyloid angiopathy[J].Brain Pathol,2006,16(1):55-59.

[2]Jaskolski M.3D domain swapping,protein oligomeriza-tion,and amyloid formation[J].Acta Biochim Pol,2001,48:807-827.

[3]Bach S,Talarek N,Andrieu T,et al.Isolation of drugs active against mammalian prions using a yeast-based screening assay[J].Nat Biotechnol,2003,21(9):1075-1081.

[4]Rambold AS,Miesbauer M,Olschewski D,et al.Green tea eatract interfere with the stress-protective activity of PrPC and the formation of PrPSc[J].J Neurochem,2008,107(1):218-229.

[5]王學(xué)美.補(bǔ)腎中藥對(duì)早期老年癡呆的治療功效[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2008，1(3)：9-12.

[6]張秋娟,張?jiān)圃?黃文燕.中醫(yī)藥治療帕金森病的思路與方法[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2004,2(1):75-77.

[7]趙敬堃,王德生.中藥與中藥有效成分治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008,28(2):177-181.

[8]Nasu Y,Iwashita M,Saito M,et al.Inhibitory effects of atractylodis lanceae rhizoma and poria on collagen- or thromboxane A2-induced aggregation in rabbit platelets[J].Biol Pharm Bull，2009,32(5):856-860.

[9]He J,Song Y,Ueyama N,et al.Prevention of amyloid fibril formation of amyloidogenic chicken cystatin by site-specific glycosylation in yeast[J].Protein

Sci，2006,15(2):213-222.

[10]Gauthier S,Kaur G,Mi W,et al.Protective mechanisms by cystatin C in neurodegenerative diseases[J].Front Biosci (Schol Ed)，2012,3:541-554.

[11]Bjarnadottir M,Nilsson C,Lindstrom V,et al.The cerebral hemorrhage-producing cystatin C variant (L68Q) in extracellular fluids[J].Amyloid，2001,8(1):1-10.

[12]Staniforth RA,Giannini S,Higgins LD,et al.Three-dimensional domain swapping in the folded and molten-globule states of cystatins,an amyloid-forming structural superfamily[J].EMBO J，2001,20(17):4774-4781.

[13]Sanders A,Jeremy Craven C,Higgins LD，et al.Cystatin forms a tetramer through structural rearrangement of domain-swapped dimers prior to amyloidogenesis[J].J Mol Biol，2004，336(1)：165-178.

[14]He J,Song Y,Ueyama N,et al.Characterization of recombinant amyloidogenic chicken cystatin mutant I66Q expressed in yeast[J].J Biochem,2005,137(4):477-485.