提高雙歧桿菌活力的優(yōu)化增菌發(fā)酵技術研究

何楓媛，葛武鵬，衛(wèi)偉，朱紅，劉銳

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100)

提高雙歧桿菌活力的優(yōu)化增菌發(fā)酵技術研究

何楓媛，葛武鵬，衛(wèi)偉，朱紅，劉銳

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100)

以MRS為基礎培養(yǎng)基，選取添加4種不同的增菌因子，即：魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉，以單因素實驗篩選出較優(yōu)的3種增菌因子，通過正交實驗以活菌數(shù)為活力評價指標，確定最佳增菌配方。結果表明，單因素實驗中，魔芋膠水解物增菌效果最佳，當其在MRS培養(yǎng)基中添加體積分數(shù)為35 mL/L時，雙歧桿菌的活菌數(shù)可達1.21×109mL-1；正交實驗所得最佳增菌配方為：MRS+魔芋膠水解物（30 mL/L）+薏苡仁浸提液（25 mL/L）+菊粉（20 g/L），37℃厭氧培養(yǎng)36 h，活菌數(shù)可達7.4×109mL-1。

雙歧桿菌；增菌因子；活菌數(shù)；正交實驗

0 引言

雙歧桿菌是定植于人體腸道內并促進人體健康的一種益生菌[1]。其多種生物學功能已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應用[2-3]。雙歧桿菌專性厭氧，對生長條件要求苛刻，活性保持較難，其生長繁殖和體外培養(yǎng)需要多種雙歧因子[4-6]。

低聚糖是一類雙歧因子。Gibson等報道了果聚糖對雙歧桿菌增殖的影響[7]。秦湘紅等人研究認為用魔芋制備葡甘露低聚糖可促雙歧桿菌體外生長[8]。李香串研究顯示薏苡仁浸提液可促進雙歧桿菌的增殖[9]。張火云等研究顯示山藥粗多糖（DOT-X）對雙歧桿菌的增殖起主要作用[10]。殷洪等研究表明菊粉可使有益菌群在腸道中占有優(yōu)勢[11]。用多種增菌因子復合增殖雙歧桿菌的研究還鮮見報道。

本文主要研究魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉這4種物質對雙歧桿菌體外增殖的影響，以期為該菌的體外培養(yǎng)提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙歧桿菌B94；魔芋，薏苡仁，山藥，菊粉。

MRS培養(yǎng)基：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，無水乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，七水和硫酸鎂0.58 g，四水和硫酸錳0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 000 mL,調節(jié)pH值至7.1，121℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Galaxy系列二氧化碳培養(yǎng)箱；PB-10pH計；SWCJ-2D型凈化工作臺；BZG30菌落計數(shù)器；TOMY ES315自動蒸汽消毒柜；XSP-2CA雙目生物顯微鏡；FA2004電子分析天平。

1.3 方法

1.3.1 魔芋膠水解物的制備

將質量分數(shù)為0.4%的魔芋精粉于37℃溶脹過夜后倒入高速組織搗碎機中攪拌10 min，放入37℃培養(yǎng)箱，保溫72 h，取出離心（4 000 r/min,15 min）,取上清液于100℃加熱20 min,將所得液濃縮至原體積的50%，既得魔芋膠水解物[12]備用。

1.3.2 薏苡仁浸提液的制備

將薏苡仁用10倍水浸泡30 min，將其煮沸，沸后在保持微沸30 min，將煮得的薏苡仁汁倒出，再加原薏苡仁10倍的水煮沸，方法同上。將兩次所得汁液混合過濾，即得薏苡仁浸提液。

1.3.3 山藥浸提液的制備

準確稱取適量山藥，按料水質量比1∶10加入三角瓶中，置于80～90℃水浴鍋保溫，3 h后用細密紗布過濾除渣，即得山藥浸提液，濃縮浸提液至山藥粗多糖的質量濃度為100 g/L。

1.3.4 活菌計數(shù)

將雙歧桿菌B94用基礎培養(yǎng)基MRS進行多次活化后，分別接種于添加不同濃度增菌因子的基礎培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h,以血球計數(shù)板法計數(shù)，重復3次，取平均值，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計分析[13]。

1.3.5 單一增菌因子促進雙歧桿菌生長試驗

選擇魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉等四種物質作為增菌因子，按不同比例加入MRS培養(yǎng)基中，其中魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液分別按20，25，30，35，40 mL/L的不同體積分數(shù)添加；山藥浸提液按3，4，5，6，7 mL/L的不同體積分數(shù)添加；菊粉按12，16，20，24，28 g/L的不同質量濃度添加。分別在以上含不同體積分數(shù)增菌因子的MRS培養(yǎng)基內以4%的比例接入已活化好的雙歧桿菌，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，按1.3.4法測定活菌數(shù)。上述各實驗均設3次重復，且各因素均以MRS基礎培養(yǎng)基作為對照組。

1.3.6 增菌因子復合配比促進雙歧桿菌生長實驗

根據(jù)單因素實驗，在MRS基礎培養(yǎng)基上，篩選魔芋膠水解物（A），薏苡仁浸提液（B），菊粉（C）等3個因素作為增菌因子，采用正交表L9(34)，以發(fā)酵液活菌數(shù)為指標，做進一步優(yōu)化，每試驗進行3次重復。篩選促進雙歧桿菌菌體生長的最佳復合配比。其正交因素與水平如表1所示。

表1 因素水平

2 結果分析與討論

2.1 雙歧桿菌增殖培養(yǎng)單因素實驗

2.1.1 魔芋膠水解物對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖1為魔芋膠水解物體積分數(shù)與活菌數(shù)目的關系。由圖1可以看出，在一定范圍內，隨著魔芋膠水解物濃度的增加，活菌數(shù)目逐漸增加，當添加量為35 mL/L時，活菌數(shù)目達到峰值，為1.21×109mL-1，而對照組的活菌數(shù)僅有2.21×108mL-1，可見魔芋膠水解物的添加對雙歧桿菌的增殖起到明顯促進作用。分析表明，當魔芋膠水解物的添加體積分數(shù)分別為25 mL/ L以及30 mL/L時，活菌數(shù)目增殖顯著（P＜0.05），當添加量為30 mL/L以及35 mL/L時，活菌數(shù)目增殖不顯著（P＞0.05），故選擇體積分數(shù)為25，30，35 mL/L作為魔芋膠水解物在正交試驗中的水平值。

2.1.2 薏苡仁浸提液對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖2為薏苡仁浸提液體積分數(shù)與活菌數(shù)目的關系。由圖2可以看出，在一定范圍內，活菌數(shù)目隨薏苡仁浸提液體積分數(shù)的增加而增加，當添加量為30 mL/L時，活菌數(shù)目達到峰值，為3.32×108mL-1，而對照組的活菌數(shù)僅有2.21×108mL-1。分析表明，當薏苡仁浸提液的添加體積分數(shù)分別為25 mL/L以及30 mL/L時，活菌數(shù)目增殖顯著（P＜0.05）；當添加量分別為30 mL/L以及35 mL/L時，活菌數(shù)目增殖不顯著（P＞0.05）。故選擇體積分數(shù)為25，30，35 mL/L作為薏苡仁浸提液在正交實驗中的水平值。

2.1.3 山藥浸提液對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖3為山藥浸提液濃度與活菌數(shù)目的關系。由圖3可以看出，添加山藥浸提液對于雙歧桿菌的增殖有一定促進作用，但增菌效果不明顯。分析發(fā)現(xiàn)，各水平組的活菌數(shù)目增殖均不顯著（P＞0.05），活菌數(shù)目最高只達到2.72×108mL-1，對照組活菌數(shù)為2.21×108mL-1，因此，在正交試驗設計中剔除該因素。

2.1.4 菊粉對雙歧桿菌體外增殖的影響

圖4為菊粉質量濃度與活菌數(shù)目的關系。由圖4可以看出，在一定范圍內，隨著菊粉濃度的增加，活菌數(shù)目逐漸增加，在菊粉質量濃度達到20 g/L時，活菌數(shù)目達到峰值為4.78×108mL-1，而對照組僅為2.21×108mL-1。分析表明，當菊粉的添加量分別為16 g/L以及20 g/L時，活菌數(shù)目增殖顯著（P＜0.05），當添加量為20 g/L以及24 g/L時，活菌數(shù)目增殖不顯著（P＞0.05），故選擇質量濃度為16，20，24 g/L作為菊粉在正交試驗中的水平值。

綜合比較看出，各因子在選取添加范圍內，各自最佳添加量對活菌增菌效果的排列順序為：魔芋膠水解物（35 mL/L）＞菊粉（20 g/L）＞薏苡仁浸提液（30 mL/L）＞山藥浸提液（6 mL/L）。

2.2 各增菌因子復合配比正交試驗

將各增菌因子按照L9(34)正交設計表進行復合配比實驗，進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，以確定3種因子的最佳增菌配比。發(fā)酵培養(yǎng)以pH值為7.1為初始pH值，溫度37℃，時間36 h，以發(fā)酵培養(yǎng)液活菌數(shù)為評價指標，試驗結果與極差分析如表2所示，相應的方差分析如表3所示。

表2中極差值與表3中F值大小順序是一致的，極差與方差結果均表明，在復合配比試驗所考察的三個增菌因子中魔芋膠水解物（A）對發(fā)酵液活菌數(shù)的影響最為顯著，各增菌因子交互作用時對菌體增殖的影響力排序依次為：魔芋膠水解物（A）＞菊粉（C）＞薏苡仁浸提液（B）。方差分析說明魔芋膠水解物與菊粉這兩種增菌因子的添加對試驗結果的影響高度顯著，而薏苡仁浸提液的添加對試驗結果影響顯著。結合表2得出最優(yōu)增菌因子組合為A2B1C2,即魔芋膠水解物的添加體積分數(shù)是30 mL/L,薏苡仁浸提液的添加體積分數(shù)是25 mL/L,菊粉的添加質量濃度是20 g/L。

表3 方差分析

2.3 驗證實驗

根據(jù)L9（34）正交實驗結果分析選出的最優(yōu)增殖因子組合，進行驗證實驗，將其添加到MRS培養(yǎng)基（pH值為7.1）中，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，進行3次重復，雙歧桿菌增菌培養(yǎng)的試驗結果高于表2的實驗結果，活菌數(shù)平均可達到7.4×109mL-1，比起對照組（2.21×108mL-1）有了很大的提高?？梢妰?yōu)化得到的增菌組合利于雙歧桿菌增殖。

2.4 討論

單因素試驗結果結果表明：山藥浸提液對雙歧桿菌增殖的促進作用不明顯，故在正交試驗中只選取了魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、菊粉這3種作為增菌因子。正交試驗結果顯示，魔芋膠水解物的添加量在25～30 mL/L范圍內時，其促進雙歧桿菌增殖的效果隨濃度的提高而提高，這一點與單因素試驗結果是相一致的。通過參照比較國內外相關研究結果，張火云等人以中藥優(yōu)化雙歧桿菌培養(yǎng)基，可使雙歧桿菌活菌數(shù)達到2.21×108mL-1[14]；孟祥晨等人[15]通過培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化，使活菌數(shù)達到2.9×109mL-1等，本研究得到的最佳復合配比增菌因子組合使雙歧桿菌在37℃，厭氧培養(yǎng)36 h時，其活菌數(shù)達到了7.4×109mL-1，增菌效果明顯，為相關研究提供了新的參考。

3 結論

（1）在以MRS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基所選取的4種增菌因子（魔芋膠水解物、薏苡仁浸提液、山藥浸提液、菊粉）中，單因素試驗結果表明：魔芋膠水解物的對對雙歧桿菌體外增殖的促進作用最好，當添加量為35 mL/L時，雙歧桿菌的活菌數(shù)可達1.21×109mL-1。

（2）正交實驗所得最佳復合增菌因子組合為魔芋膠水解物(30 mL/L)、薏苡仁浸提液(25 mL/L)、菊粉(20 g/L)，經(jīng)添加了該增菌因子組合的MRS培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)36h,雙歧桿菌活菌數(shù)可達7.4×109mL-1。

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Research on the optimistic fermentation technology of the activities of Bifidobacterium

HE Feng-yuan，GE Wu-peng，WEI Wei，ZHU Hong，LIU Rui
(College of Food Science and Technology,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

Viable counts ofBifidobacteriumis one of the key criterions to improve human body health.The study adopted MRS as basic medium,and four optimal ingredients were chosen and added:Konjac Gum Hydrolyzates,Extractive Juice of Semen Coins,Extractive Juice of Yam,Inulin.Through single-factor test,3 better optimal ingredients were sifted out.To take the viable counts as index,orthogonal experiment was used to select a formula which is the best to enriching high activitybifidobacterium.The experimental result showed that in singlefactor test,Konjac Gum Hydrolyzate had the best effect to enrichingbifidobacteriumamong the above 4 factors，and the additive concentration was MRS added with Konjac Gum Hydrolyzates(35 mL/L),with the viable counts being 1.21×109CFU/mL.Orthogonal test showed that the optimum medium was MRS added with Konjac Gum Hydrolyzates(30 mL/L),Extractive Juice of Semen Coins(25 mL/L),Inulin(20 g/L),incubated under anaerobic conditions for 36h at 37℃,with the viable counts being 7.4×109CFU/mL.

Bifidobacterium;optimal ingredient;viable counts;orthogonal test

Q93-335

A

1001-2230（2012）05-0016-04

2011-11-04

西北農林科技大學人才基金資助項目(22050205)。

何楓媛（1989-），女，本科，研究方向為乳品科學及生物技術。

葛武鵬