高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定

萬翠香，章昭琳，王報貴，魏華，甘艷云

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌 330047；2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，南昌 330047；3.江西省新余市農(nóng)業(yè)局，江西新余 338000）

高黏附力雙歧桿菌的篩選與鑒定

萬翠香1,2，章昭琳1，王報貴1，魏華1,2，甘艷云3

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌 330047；2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，南昌 330047；3.江西省新余市農(nóng)業(yè)局，江西新余 338000）

利用體外細胞培養(yǎng)法，從實驗室現(xiàn)有的10株雙歧桿菌中篩選具有較強粘附能力的菌株。采用革蘭氏染色法和平板計數(shù)法，評價了這10株雙歧桿菌對HT-29細胞的粘附性能，通過測定這10株雙歧桿菌的16S rRNA基因序列（16S rDNA）進行分類學鑒定。結(jié)果顯示，WBBI01，WBBI02，WBIN03，WBBI06具有極強的黏附力，其黏附指數(shù)分別達1.97×103，2.17×103，3.57×103，1.88×103。經(jīng)16S rDNA測序鑒定WBBI01，WBIN03，WBBI06均與兩歧雙歧桿菌S17有極高的同源性，而WBBI02屬于長雙歧桿菌。結(jié)果表明，雙歧桿菌黏附性能具有明顯的種屬特異性，不同種屬雙歧桿菌的粘附能力相差極大，以兩歧雙歧桿菌的黏附性能最強，嬰兒長雙歧桿菌為最弱。

益生菌；16S rDNA；黏附；雙歧桿菌；黏附指數(shù)

0 引言

雙歧桿菌是動物腸道內(nèi)最重要的生理性細菌之一，能與腸道上皮細胞緊密聯(lián)系形成生物學屏障[1，2]，而黏附是其與宿主相互作用的第一步[3]，外源雙歧桿菌能否在腸道內(nèi)黏附和定殖是評定益生菌制劑效果的指標之一。因此對雙歧桿菌黏附性能的研究具有重要的實際意義。

本研究采用體外細胞培養(yǎng)法[4]，以實驗室現(xiàn)有的10株雙歧桿菌為對象，通過革蘭氏染色法和平板計數(shù)法評價各雙歧桿菌的黏附性能，篩選具有較強黏附力的菌株；采用分子生物學手段對各雙歧桿菌進行了鑒定，并結(jié)合DNAMAN軟件分析了各菌株之間親緣關系。本研究為雙歧桿菌的黏附機制及保護作用研究提供了良好的模式材料和方法，篩選獲得的高黏附性能的雙歧桿菌菌株為開發(fā)益生菌制劑提供材料。

1 實驗

1.1 材料

菌株和細胞：10株雙歧桿菌均由本實驗室保藏；人結(jié)腸癌細胞系HT-29細胞株由南昌大學一附院饋贈。

培養(yǎng)基：MRS（Solarbio）；DMEM培養(yǎng)液（Hyclone）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；胎牛血清（GIBCO），pH 7.4 PBS緩沖液，Taq PCR mix（Takara），T-載體（Takara）。

主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），低速離心機（湘儀離心機），倒置光學顯微鏡，厭氧培養(yǎng)箱，血球計數(shù)板等。

1.2 方法

1.2.1 雙歧桿菌的細胞黏附實驗[5]

HT-29細胞常規(guī)培養(yǎng)，實驗之前將細胞接至6孔細胞板培養(yǎng)14 h，每孔中加入1 mL益生菌的菌懸液(細菌數(shù)為1×108～2×108mL-1)和1 mL新鮮的DMEM[6]（pH=4.5）培養(yǎng)液，于37℃質(zhì)量分數(shù)為5%的CO2，質(zhì)量分數(shù)為95%空氣的二氧化碳培養(yǎng)箱中共孵育3 h。孵育結(jié)束后，輕柔吸走上清，預冷PBS漂洗細胞4次，以除去未黏附的細菌，甲醛固定，革蘭氏染色，鏡檢初步評價黏附能力。

1.2.2 雙歧桿菌的細胞黏附能力測定

將黏附結(jié)束的細胞培養(yǎng)板用2 mL冷PBS輕柔洗滌4次，之后加入400 L胰蛋白酶消化液消化1 min，加入600 L預冷的PBS終止反應并輕輕吹打，將細胞及黏附的細菌制成菌懸液，吸到試管中，在振蕩器上充分振蕩，使細菌能夠分散懸浮[7,8]。然后將菌懸液進行梯度稀釋，稀釋到105，然后從各個稀釋度取10 L分區(qū)點滴到MRS平板培養(yǎng)基上，吹干后倒置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后，進行活菌計數(shù)，每株設立兩個平行樣本，每樣本設立3個重復。對照組細胞培養(yǎng)皿的細胞懸液用血細胞計數(shù)板對細胞個數(shù)進行計數(shù)。根據(jù)活菌計數(shù)的結(jié)果以及對照培養(yǎng)皿細胞計數(shù)的結(jié)果，計算雙歧桿菌對HT-29[9]細胞的黏附效果。黏附指數(shù)以100個細胞上黏附的細菌數(shù)表示。

1.2.3 高黏附力雙歧桿菌的鑒定

利用16S rDNA分子生物學特征鑒定[10]。根據(jù)V3區(qū)兩端保守區(qū)設計引物，則能夠擴增細菌V3區(qū)相對應的可變區(qū)片段，測序分析比較來初步確定菌種的位置。設計引物為F:5’-GGTGAGAGTGGCGAACGGGT-3’，R:5’-AACGAGCGCAACCCTCGC-3’。以待測菌基因組為模板進行PCR擴增，PCR反應條件：95℃10 min，然后于94℃10 min，67℃30 s，72℃1.5 min擴增30個循環(huán)，72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆到T載體上進行測序。序列的同源性在GeneBank數(shù)據(jù)庫中使用BLAST工具進行比較，并確定待測菌的分類地位。

2 結(jié)果

2.1 革蘭氏染色法檢測10株雙歧桿菌的黏附能力

通過放大80倍的顯微鏡觀察了10株雙歧桿菌對HT-29細胞的黏附能力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，雙歧桿菌屬的各種間不同菌株在體外對HT-29細胞的黏附能力相差很大，其中WBBI01, WBBI02,WBIN03,WBBR05,WBBI06,WLABO9雙歧桿菌均有較強的黏附力，WBBR04與WBLO01的黏附力較弱，而WBAN07雙歧桿菌黏附力極弱或幾乎沒有。

2.2 平板計數(shù)法評價10株雙歧桿菌的黏附能力

結(jié)果顯示：10株雙歧桿菌對HT-29細胞的黏附指數(shù)(菌體數(shù)目/100 HT-29 cell)分別為1.97×103，2.17× 103，3.57×103，2.82×102，1.71×103，1.88×103，5.00× 10，5.71×102，9.14×102，3.06×102，如圖2所示。

2.3 雙歧桿菌的16SrDNA鑒定

提取菌株的總DNA進行PCR擴增，得到約1.4 kb的DNA片段?？寺y序后，將測定結(jié)果用Blastn進行序列同源性比對，根據(jù)比對結(jié)果分析10株菌株，采用16S rDNA序列分析的方法鑒定到屬，具體結(jié)果如表1所示。

表1 16S rDNA鑒定結(jié)果

2.4 10株雙歧桿菌的同源性分析

本研究選取了4個系統(tǒng)發(fā)生組的雙歧桿菌典型株/標準株，另外以位于高GC含量的革蘭氏陽性菌Listeria monocytogenesM7作為外群，基于Clustal V計算方法構(gòu)建了以16S rDNA序列為基礎的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖（見圖3）。

圖3中，顯示了所測序的10株雙歧桿菌與其它同屬標準株以及其它細菌的親緣關系。樹狀圖通過DNAMAN軟件中的Align程序基于Clustal V方法構(gòu)建，并以Listeria monocytogenesM7作為外群。樹狀圖上方標尺bar（0.05）為千個核苷酸的替換率。

3 討論

雙歧桿菌在腸道中的黏附及定植，對維持腸道菌群的結(jié)構(gòu)及功能起主導作用，因此，研究雙歧桿菌的黏附機制對認識微生態(tài)學的基本規(guī)律有著重要意義。粘附性能檢測是益生菌篩選的重要指標之一[11-12]，目前國內(nèi)外學者普遍采用體外培養(yǎng)腸上皮細胞的方法來評價菌株的黏附能力[13]。

1985年Huub等人開啟了雙歧桿菌黏附作用研究的先河，但其研究僅針對兩歧雙歧桿菌的脂磷壁酸(LTA)，因此具有一定的局限性。20世紀90年代，Elo等人[14]采用體外細胞培養(yǎng)方法研究了4株雙歧桿菌對人腸癌細胞(Caco-2)的粘附能力，其研究發(fā)現(xiàn)：兩歧雙歧桿菌12-1和SBT 2752，長雙歧桿菌SBT-2919和SBT2934均對Caco-2細胞幾乎沒有粘附或粘附力非常弱。2005年Candela等人[15]同樣采用體外細胞培養(yǎng)方法對比了7株雙歧桿菌菌株對人腸道上皮細胞(Caco-2)的黏附能力，其研究表明雙歧桿菌對Caco-2的黏附具有種屬特異性，其中兩歧雙歧桿菌S17的黏附值(菌體數(shù)目/100 Caco-2cell)高達5.85×103，而長雙歧桿菌E18和動物雙歧桿菌BBSF的黏附力較弱，其黏附值(菌體數(shù)目/100 Caco-2cell)分別為1.94×102,1.77×102。Crociani等人[16]將體外細胞培養(yǎng)方法與體內(nèi)試驗進行了比較，驗證了雙歧桿菌體外黏附實驗的準確性，為以后體外細胞培養(yǎng)方法研究雙歧桿菌黏附作用提供了理論依據(jù)。

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的基因，長度約為1 500 bp，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”，若16S rRNA基因相似性大于97%，可以斷定其為同一個屬，并且初步認為其為同一個菌種(Gerald,2005)[17]。經(jīng)典的菌株分類鑒定方法的最大缺陷在于即使進行了完整的各種鑒定試驗，也可能導致對所分離的菌株鑒定結(jié)果的不確定性。與之相比，16S rDNA全序列分析鑒定法具有簡便、快速、靈敏和經(jīng)濟的優(yōu)點，是目前應用最廣的分子微生物學檢測的靶基因，已被眾多學者用來對細菌的快速鑒定[18]。2004年涂宏鋼等人利用16S rRNA全長序列鑒定了植物乳桿菌；2005年付曉艷等人通過16S rDNA測序?qū)⒔Y(jié)果與同屬及非同屬的乳酸菌進行同源性比較，鑒定了乳酸乳球菌；2009年張朝正等人[10]利用16S rDNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產(chǎn)脂肪酶菌株；2011年詹鑾峰等人[19]將16S rDNA檢測法應用到臨床細菌的檢驗中，其研究通過設計合成所有細菌的通用引物，實現(xiàn)了一個樣品中同時檢測多種細菌。本研究所用的雙歧桿菌對照株序列同測定序列的16S rRNA基因進化分析表明，其在16S rDNA序列相似性基礎上聚類為3個簇群：Bifidobacterium bifidum;Bifidobacterium animalis;Bifidobacterium longum.本研究中的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可以顯示出這種進化模式，可以看出所分析的10株細菌起源于同一祖先。

本研究結(jié)合了各雙歧桿菌黏附實驗的優(yōu)化方案，采用體外細胞培養(yǎng)法，以實驗室現(xiàn)有的10株雙歧桿菌為對象，篩選具有較強黏附能力的菌株。黏附結(jié)果表明，雙歧桿菌各種屬間不同菌株在體外對HT-29細胞的黏附能力相差很大，其中WBBI01,WBBI02,WBIN03, WBBR05,WBBI06,WLABO9雙歧桿菌均有較強的黏附力，WBIN03具有最高的黏附值(菌體數(shù)目/100 HT-29 cell)：3.57×103。本研究篩選獲得的高黏附性能的雙歧桿菌菌株為開發(fā)益生菌制劑提供了材料[20]。

[1]尤萍,馬玉龍.雙歧桿菌對腸上皮細胞粘附作用的研究機應用展望.飼料工業(yè)，2004,25:42-6.

[2]劉國榮，潘偉好，暢曉淵等.雙歧桿菌的粘附特性及其對腸道致病菌的體外拮抗作用.微生物學通報，2009,36:716-21.

[3]孟祥晨，霍責成，張建友等.雙歧桿菌對腸上皮細胞粘附作用研究狀況.中國乳品工業(yè).2002,30:0003-04.

[4]魏銀萍，王斌，魏泓.益生菌株對HT-29細胞的粘附及對致病菌的粘附抑制性能研究.藥物研究,2006,15(8):0007-02.

[5]張毅強,師帥帥.人大腸癌細胞原代培養(yǎng)方法的改進.吉林醫(yī)學，2010,31:442-4.

[6]林雪彥，牛鐘相.動物消化道乳酸菌粘附機制及影響因素研究進展.家畜生態(tài)學報,2006,27:0109-04.

[7]LIU C,ZHANG Z Y,DONG K,et al.Adhesion and Immunomodulatory Effects of Bifidobacterium lactis HN019 on Intestinal Epithelial Cells INT-407[J].World J Gastroenterol,2010,16:2283-2290.

[8]CANDELA M,PERNA F,CARNEVALI P,et al.Interaction of Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium Strains with Human Intestinal EpithelialCells:AdhesionProperties,CompetitionagainstEnteropathogens and Modulation of IL-8 Production[J].International Journal of Food Microbiology,2008,125:286-292.

[9]劉長寶陳愛華,凌志強.HT-29腸癌細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附特性及作用機制研究.溫州醫(yī)學院學報，2007,37:0429-04.

[10]張朝正，郭蘭珍.利用16S rDNA序列分析和Biolog快速鑒定方法鑒定產(chǎn)脂肪酶菌株.河北工業(yè)大學學報，2009,38(5):0052-04.

[11]PREISING J,MARITA G,HUA W,et al.Selection of Bifidobacteria Based on Adhesion and Anti-Inflammatory Capacity In Vitro for Amelioration of Murine Colitis[J].Applied and Enviromental Microbiology,2010,76:3048–3051.

[12]周佳青,周梁,金曉杰.細胞因子IFN-γ和IL-1β對人喉鱗癌細胞粘附和浸潤能力的影響.中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2005,11(4): 0217-04.

[13]RIEDEL C U,FRANCIS F,DARLENE R G,et al.Interaction of Bifidobacteria with Caco-2 Cells adhesion and Impact on Expression Profiles[J].International Journal of Food Microbiology,2006,110:62-68.

[14]ELO S M.Attachment of Lactobacillus Casei Strain GG to Human Colon Carcinoma Cell Line Caco-2：Comparison with Other Dairy Strains[J].Letters in Applied Microbiology,1991,13:154-156.

[15]CANDELA M,SEIBOLD G,VITALI B,et al.Real-time PCR Quantification of Bacterial Adhesion to Caco-2cells:Competition between Bifidobacteria and Enteropathogens[J].Res Microbiol, 2005,156(8):887-895.

[16]CROCIANI J.Adhesion of Different Bifidobacteria Strains to Human Enterocyte-Like Caco-2 Cells and Comparison with in Vivo Syudy [J].Letters in Applied Microbiology 1995;21:146-148.

[17]GERALD W T.Probiotics and Prebiotics-Scientific Aspects[J],Caister Academic Press，2005,12-38.

[18]王宏梅,于潔,包秋華，等.利用16S rDNA序列及tuf-RFLP鑒定蒙古國發(fā)酵乳中的乳酸菌.中國乳品工業(yè),2011,39(7):4-5.

[19]詹鑾峰,高鵬.16SrDNA檢測在臨床細菌檢驗中的應用,2011,07: 1140-1143.

[20]陳曦.乳桿菌屬的益生菌保健功能及研究進展.中國乳品工業(yè), 2011,39(7):0040-04.

Screening and Identification of high adhesion Bifidobacteria to HT-29 Cell

WAN Cui-xiang1,2,ZHANG Zhao-lin1,WANG Bao-gui1,WEI Hua1,2,GAN Yan-yun3
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China；2.Jiangxi-OAI Joint Research Institute,Nanchang 330047,China；3.Jiangxi Xinyu Agricultural Bureau，Xinyu,338000,China)

The adhesion capacity of tenBifidobacteria strainsin vitro was investigated.Gram staining and plate counting method were used to evaluate their adhesion capacity to HT-29 cell,and 16S rDNA sequencing analysis was carried out to identify the strain..Based on the data in vitro,High attachment was observed inBifidobacteriaWBBI01,WBBI02,WBIN03,WBBI06,their adhesion index reached(bacterial cells/100 Caco-2 cells)1.97×103，2.17×103，3.57×103，1.88×103repectively,while low attachment was shown in other strains.Identification of the strain indicates that the homology ofBifidobacteriaWBBI01,WBIN03,WBBI06 with B.bifidumS17 were all above 99%,WBBI02 belongs toB.longum.The adhesion capacity varied considerably among different strains.B.bifidumWBIN03 was the most adhesive and the adhesion ability ofBifidobacteriaWBAN07 was the weakest among all the tested strains.

Bifidobacteria;16S rDNA sequencing;Identification;Adhesive activity

Q93-33

A

1001-2230（2012）05-0013-03

2011-12-26

國家自然科學基金項目（30900038），國家“863”計劃專題（2008AA10Z337），國家自然科學基金項目（31000048），2009年江西省主要學科學術和技術帶頭人培養(yǎng)計劃，江西省教育廳科研基金（GJJ10379）。

萬翠香（1977-），女，副教授，主要從事益生菌的分子生物學研究。

章昭琳

book=33,ebook=163