產(chǎn)抗菌肽乳源乳酸菌的篩選及定向培養(yǎng)

喬彬，高學軍，潘洪寶，于微，尹德云

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

產(chǎn)抗菌肽乳源乳酸菌的篩選及定向培養(yǎng)

喬彬，高學軍，潘洪寶，于微，尹德云

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

為了獲得乳酸菌高效表達抗菌肽的代謝調(diào)控方法，對德氏乳桿菌保加利亞亞種等7種乳酸菌進行了產(chǎn)抗菌肽能力的篩選和定向培養(yǎng)。篩選出具有較高抑菌活性的菌株嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，它們產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)經(jīng)排除酸、過氧化氫后，仍具有抑菌活性，然而經(jīng)蛋白酶處理后其抑菌活性明顯下降。結(jié)果表明，兩種菌發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用。經(jīng)一系列定向培養(yǎng)嗜酸乳桿菌抑菌直徑達到（23.53±0.06）mm，與未經(jīng)定向培養(yǎng)的抑菌直徑（11.63±0.15）mm相比抑菌活性提高了102%；經(jīng)定向培養(yǎng)的干酪乳桿菌抑菌直徑達到（21.27±0.25）mm，與未經(jīng)定向培養(yǎng)的抑菌直徑（12.50±0.10）mm相比抑菌活性提高了70.2%。

乳源乳酸菌；抗菌肽；篩選；定向培養(yǎng)；抑菌活性

0 引言

乳酸菌是目前世界公認安全的食品級微生物，它們產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是安全的，可作為天然食品防腐劑直接應(yīng)用于食品工業(yè)和畜牧業(yè)，因此乳酸菌抗菌能力的挖掘和開發(fā)受到了國內(nèi)外極大關(guān)注[1]。齊桂云報道了乳酸桿菌抗菌肽的生物學性質(zhì)，證實該抗菌肽分子質(zhì)量為14 ku，可被胰蛋白酶降解[2]。Lemos從食物源339個乳酸菌株中篩選抗微生物活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)腸球菌能夠產(chǎn)生抗多種菌的抗菌肽[3]。Lasta鑒定了乳酸球菌亞種產(chǎn)生的抗菌肽J46，是一個27肽，對G+菌具有很強的抗性[4]。定向培養(yǎng)可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基營養(yǎng)成份促進乳酸菌產(chǎn)生更多的抗菌肽，是獲得超表達抗菌肽的代謝調(diào)控方法。本實驗通過篩選產(chǎn)抗菌肽高的乳源乳酸菌，并采用進行定向培養(yǎng)方法以提高產(chǎn)抗菌肽的能力，為乳源乳酸菌抗菌肽的進一步應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 實驗

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

供試菌：德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、腸膜明串珠球菌、瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種（本實驗室保存菌種）；指示菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（本實驗室保存菌種）。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基（pH值為6.2～6.4）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂粉18.0 g（固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)基不加），蒸餾水1 000 mL用于細菌分離。NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L（均為質(zhì)量濃度），pH值為7.2～7.4，121℃滅菌15 min，用于指示菌培養(yǎng)。

1.1.3 生理生化鑒定管

葡萄糖，乳糖，麥芽糖，蔗糖，果糖，V·P反應(yīng)，纖維二糖，阿拉伯糖，木糖，棉籽糖，山梨醇，甘露醇，松三糖（細菌微量生化反應(yīng)管）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌種的篩選鑒定

（1）乳酸菌的分離純化。將冷凍干燥的供試菌接種在MRS液體培養(yǎng)基進行活化。乳桿菌采用MRS液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24 h。每次測定之前,各菌株均在各自培養(yǎng)基上活化3次以保證菌株的活力得到恢復。然后挑出單一菌落，革蘭氏染色，鏡檢，若菌種單一則-80℃凍存。

（2）產(chǎn)生抑菌活性代謝產(chǎn)物乳桿菌的初篩。采用牛津杯瓊脂擴散法進行抑菌活性的篩選。首先將待測菌株活化,培養(yǎng)液經(jīng)離心(4℃、12 000 r/min、5 min)得發(fā)酵上清液。將指示菌懸濁液涂布于NB固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基上放置4個牛津杯,杯中加入200 μL乳酸菌發(fā)酵上清液,37℃培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑(mm),確定其抑菌效果。每個樣品做三次平行實驗，選取有明顯抑菌圈的菌株做復篩實驗。

（3）酸排除實驗。以1%的接種量接種于5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液以12 000 r/min離心5 min后，用濃度為1.0 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)整發(fā)酵上清液的pH值為5.0，采用牛津杯瓊脂擴散法測定發(fā)酵液和有機酸的抑菌活性。

（4）過氧化氫排除實驗。過氧化氫酶溶解在磷酸緩沖液（pH7.0）中配成母液，加入到pH調(diào)至7.0的發(fā)酵上清液中，使過氧化氫酶的終質(zhì)量濃度為5 g/L，在37℃水浴中溫育2 h后取出，再將pH值調(diào)回對照pH值為5.0，用牛津杯檢測經(jīng)過氧化氫酶處理后發(fā)酵液的抑菌圈大小。

（5）蛋白酶對其抑菌的影響。將發(fā)酵上清液的pH調(diào)至各酶的最適pH值,按質(zhì)量濃度1.5 g/L的比例分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K,在各自適宜的溫度下處理1 h后,沸水浴處理3 min使酶失活,冷卻后調(diào)pH值為5,測定抑菌活性的變化情況。

（6）產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的抑菌譜。將發(fā)酵上清液調(diào)至pH值為5.0，分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌為指示菌做抑菌實驗，觀察乳酸菌的抑菌譜。

（7）菌株的鑒定。生理生化特性鑒定：根據(jù)分離菌的菌落和菌體形態(tài)特征，革蘭氏染色以及生理生化反應(yīng)，參照《柏杰氏細菌鑒定手冊》[8]第9版和《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》進行鑒定。

16SrDNA序列分析：對步驟（2）中篩選出的抑菌直徑大的菌種進行16SrDNA序列分析，然后用細菌通用引物進行PCR擴增，回收產(chǎn)物送去測序（本實驗引物合成及測序均在上海英俊生物科技有限公司進行）。

（8）生長曲線的測定。將種子液以1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,30℃恒溫靜置培養(yǎng),在48 h內(nèi),每隔2 h取樣,測定發(fā)酵液在600 nm處的吸光值OD600。

1.2.2 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化

將篩選得到的抑菌活性高的菌株活化，接入NB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：接種量4%，溫度30℃,裝液量為200 μL/5 000 μL，金黃色葡萄球菌為指示菌，測定抑菌圈直徑。

（1）碳源調(diào)節(jié)對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。在NB培養(yǎng)基中，分別加入1%的葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、殼聚糖作為碳源，并以不加以上碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，將對照的抑菌直徑設(shè)為100%，選出最佳碳源后再對其添加量進行優(yōu)化，添加量分別設(shè)為0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，4%，5%。

（2）氮源調(diào)節(jié)對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。方法如1.2.2（1），固定碳源添加量，以1%的不同氮源牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿、豆粕粉、硝酸鉀、硫酸銨取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的牛肉膏、蛋白胨。添加量分別設(shè)為0.5%，1%，2%，3%，4%，5%。

（3）無機鹽調(diào)節(jié)對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。方法如上，固定碳源、氮源添加量，分別以0.1%的CaCl2，NaCl，MgSO4，KH2PO4，F(xiàn)eCl3的金屬離子取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaCl，添加量分別設(shè)為0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%。

（4）表面活性劑調(diào)節(jié)對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。方法如上，固定碳源、氮源、無機鹽添加量，分別向其中加入0.5%Tween-80和Tween-20，添加量分別設(shè)為0.1%，0.5%，1.0%，1.5%。

（5）通過正交試驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。為確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分，試驗采用正交設(shè)計，通過單因素試驗，確定正交試驗的各因素水平，對于嗜酸乳桿菌設(shè)蔗糖、牛肉膏、NaCl和Tween-80四個因素；對于干酪乳桿菌設(shè)蔗糖、大豆蛋白胨、NaCl和Tween-80四個因素，每個因素設(shè)三個水平，進行搖瓶發(fā)酵試驗，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分，試驗用L9(3)4正交表安排設(shè)計。

（6）代謝前體物的添加對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。在優(yōu)化培養(yǎng)基中分別以添加量為1%加入代謝前體物尿素、Na2SO4。

（7）初始pH對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。用濃度為0.1 mol/L的HCl及0.1 mol/L的NaOH溶液將優(yōu)化培養(yǎng)基溶液調(diào)至pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，最后定容至相同體積，4%接種量，觀察不同初始pH對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。

（8）培養(yǎng)溫度對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。使乳酸菌發(fā)酵液分別在20，30，40，50，60℃條件下培養(yǎng)，觀察其對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。

（9）抗菌肽熱穩(wěn)定性研究。分別取發(fā)酵上清液1 mL，分別在40，60，80，100，120℃溫度下處理30 min，做抑菌試驗，觀察結(jié)果。

（10）拮抗作用。將活化的乳酸菌接200 μL到5 mL優(yōu)化培養(yǎng)基中40℃培養(yǎng)24 h后，再將活化的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別吸取200 μL加入到乳酸菌培養(yǎng)液中，分別在24，48，72，96，120 h對培養(yǎng)液做抑菌試驗，測定抗菌活性并且計算有害菌存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌種的篩選鑒定結(jié)果

（1）乳酸菌的分離純化結(jié)果。根據(jù)菌種菌落形態(tài)學特征的描述，菌株經(jīng)過反復平板劃線得到純化，經(jīng)過格蘭氏染色、電鏡觀察、生理生化實驗鑒定，7種乳酸菌均得到單一菌落。

（2）產(chǎn)生抑菌活性代謝產(chǎn)物乳桿菌的初篩結(jié)果。對7種乳酸菌進行抑菌活性測定，選取2種高產(chǎn)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生菌，分別為干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌。

（3）中和法排除有機酸。乳酸和乙酸對指示菌無抑制作用，排除酸作用后，嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵上清液均有較好抑菌作用，結(jié)果如表1所示。

表1 兩菌種發(fā)酵上清液及調(diào)節(jié)pH后發(fā)酵上清液的抑菌圈大小

（4）過氧化氫酶檢測排除過氧化氫。兩種菌株發(fā)酵上清液經(jīng)過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑和發(fā)酵上清原液相比變化不大，說明過氧化氫也不是主要的抑菌物質(zhì),發(fā)酵上清液中還有其他的抑菌活性物質(zhì)存在。

表2 過氧化氫酶處理前后發(fā)酵上清液的抑菌圈大小

（5）蛋白酶檢測抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)。兩種菌株pH值為5時的發(fā)酵上清液有較大抑菌圈，被胰蛋白酶作用后抑菌圈消失，此抑菌物質(zhì)能被胰蛋白酶、胃蛋白酶分解，同時經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后，抑菌活性也會完全喪失，產(chǎn)生白色沉淀。說明抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。此抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶敏感，同時對木瓜蛋白酶、蛋白酶K不敏感。

（6）產(chǎn)抗菌肽乳酸菌的抑菌譜。兩種菌株產(chǎn)生的抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有很好的抑制效果。

（7）菌種的鑒定。24 h培養(yǎng)物經(jīng)革蘭氏染色，根據(jù)形態(tài)特征觀察，常規(guī)生理生化鑒定及16S rDNA序列的分析，將此2種菌株鑒定為嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌。

（8）生長曲線測定。兩種乳酸菌菌數(shù)在開始時緩慢上升，經(jīng)12 h培養(yǎng)后數(shù)量級迅速上升，進入對數(shù)生長期。嗜酸乳桿菌在27 h后進入生長平臺期，直到發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)液OD值基本上沒有變化。干酪乳桿菌在24 h進入生長平臺期。

2.2 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分優(yōu)化結(jié)果

（1）營養(yǎng)成份調(diào)節(jié)對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響。實驗結(jié)果表明嗜酸乳桿菌最佳培養(yǎng)條件：蔗糖3.0%，牛肉膏4.0%，NaCl 0.6%，Tween-80 1.5%，抑菌直徑（20.47±0.12）mm。干酪乳桿菌最佳培養(yǎng)條件：蔗糖1.0%，大豆蛋白胨3.0%，NaCl 0.7%，Tween-80 1.0%,抑菌直徑（19.17±0.15）mm。

（2）正交試驗優(yōu)化結(jié)果。通過用L9(3)4正交安排設(shè)計單因素試驗，確定正交試驗的各因素水平。選出最佳配比。嗜酸乳桿菌測定結(jié)果：蔗糖3%，牛肉膏4%，NaCl 0.6%，Tween-80 1.0%。干酪乳桿菌測定結(jié)果：蔗糖1%，大豆蛋白胨3%，NaCl 0.8%，Tween-80 1.0%

（3）代謝前體物的影響結(jié)果。代謝前體物對兩種乳酸菌的影響如表3所示。由表3可以看出，尿素在一定程度上可以促進嗜酸乳桿菌產(chǎn)抗菌肽，對于干酪乳桿菌兩種代謝前體物對其產(chǎn)抗菌肽都有一定的抑制作用。

表3 代謝前體物對兩種乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響

（4）初始pH值的影響。如表4所示，當pH值為5.0時嗜酸乳桿菌抑菌活性最高。當pH值為6.0時，干酪乳桿菌抑菌活性最高。說明培養(yǎng)基過堿時，不利于菌體生長和抗菌肽的產(chǎn)生。

（5）培養(yǎng)溫度的影響結(jié)果。溫度對兩種乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的抑菌活性有較大影響，顯示40℃時抗菌肽抑菌活性單位最高。

（6）抗菌肽熱穩(wěn)定性研究結(jié)果。發(fā)酵上清液經(jīng)40，60，80，100，120℃溫度下處理30 min，做抑菌試驗，結(jié)果顯示抑菌直徑無規(guī)律性變化，說明抑菌活性物質(zhì)對熱有很強的耐受性（如表5）。

（7）拮抗作用影響結(jié)果。拮抗作用實驗結(jié)果如表6所示。由表6可以看出，拮抗作用能明顯促進乳酸菌產(chǎn)生更多抗菌肽，同時發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌促進效果更明顯。兩種乳酸菌在拮抗作用72 h時達到最大值，嗜酸乳桿菌達到（23.50±0.10）mm，干酪乳桿菌達到（21.23±0.21）mm。72 h之后抗菌肽含量達到平穩(wěn)。當嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌分別與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)48 h后，金黃色葡萄球菌與大腸桿菌均得到很好的抑制，120 h后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌完全被抑殺。

表4 初始pH值調(diào)節(jié)對兩種乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響mm

表5 溫度對抗菌肽熱穩(wěn)定性的影響mm

表6 拮抗作用對乳酸菌產(chǎn)抗菌肽的影響mm

3 結(jié)論

（1）通過對7種乳源乳酸菌進行抑菌試驗比較，表明嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌能產(chǎn)生較多抗菌肽。

（2）嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌經(jīng)過培養(yǎng)基營養(yǎng)成份的調(diào)節(jié)，抑菌效果明顯提高，嗜酸乳桿菌最高達到（20.47±0.12）mm，干酪乳桿菌最高達到（19.17±0.15）mm。嗜酸乳桿菌最優(yōu)培養(yǎng)基：蔗糖3%，牛肉膏4%，NaCl 0.6%，Tween-80 1.0%。干酪乳桿菌最優(yōu)培養(yǎng)基：蔗糖1%，大豆蛋白胨3%，NaCl 0.8%，Tween-80 1.0%。

（3）嗜酸乳桿菌與干酪乳桿菌所產(chǎn)抗菌肽經(jīng)100℃處理30 min仍有較高活性，并對胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感。對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有不同程度的抑制，是一類廣譜抗菌肽。

（4）在嗜酸乳桿菌與干酪乳桿菌培養(yǎng)24 h后分別添加金黃色葡萄球菌及大腸桿菌，能有效的促進嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌產(chǎn)生抗菌肽，增強抑菌活性。抑菌活性達到最高值后穩(wěn)定存在。在共培養(yǎng)120 h后，兩種有害菌均被殺滅，可能與培養(yǎng)基有利于乳酸菌生長和產(chǎn)生大量抗菌肽有關(guān)，其機理有待進一步研究[9]。

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[7]周德慶.微生物學教程[M].北京:高等教育出版社,2002:372-373.

Selection of milk-source Lactic acid bacteria producing antimicrobial peptides and cultivation for antimicrobial activity

QIAO Bin,GAO Xue-jun,PAN Hong-bao,Yu Wei,Yin De-yun
(Northeast Agricultural University.The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,,Harbin 150030,China)

In order to obtain metabolism control methods for high expression of antimicrobial peptides of lactic acid bacteria.In this experiment,Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus etc.seven kinds of lactic acid bacteria were isolated and identified and cultured for antimicrobial activities.Excluding the interference of organic acids and hydrogen peroxide,the high antibacterial activities of these lactic acid bacteria were selected.The fermentation supernatant of these two kinds of lactic acid bacteria lost antimicrobial activity in the presence of trypsin.The fermentation supernatant of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei had inhibitory spectrum against Staphylococcus aureus and E.coli. After the series of target cultivation,the antibacterial diameter of Lactobacillus acidophilus was(23.53±0.06)mm,while without the target cultivation Lactobacillus acidophilus antibacterial diameter was(11.63±0.15)mm,the antibacterial activity rised by 102%.After target cultivation, antibacterial diameter of Lactobacillus casei was(21.27±0.25)mm,while without target cultivation the antibacterial diameter of Lactobacillus casei was(12.50±0.10)mm,antimicrobial activity rised by 70.2%.

Milk-source lactic acid bacteria;antimicrobial peptides;selection;target cultivation;antibacterial activity

Q93-331，Q93-335

A

1001-2230（2012）01-0025-04

2011-09-08

教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目(IRT0959,NEAU)。

喬彬（1986-）,女,碩士研究生,研究方向為乳酸菌應(yīng)用生物技術(shù)。

高學軍