高效稠油降解菌DL1-G的篩選及降解特性

任妍君 ,陳梅梅 ,岳 勇 ,王 磊 ,王 靖 ,王萬福 (.中國石油集團(tuán)安全環(huán)保技術(shù)研究院,北京049；.中國石油大學(xué)化工學(xué)院,北京 0008；.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院,北京 0009)

石油泄漏進(jìn)入環(huán)境后,少量組分揮發(fā)或降解,而大部分成分包括長鏈飽和烴、多環(huán)芳烴等組分不易揮發(fā)、有毒、難降解[1],且能隨食物鏈富集[2].稠油成分復(fù)雜,長鏈飽和烴、芳烴、瀝青質(zhì)等重質(zhì)組分含量較高,對生態(tài)環(huán)境和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅. 研究表明,微生物降解是環(huán)境中石油去除的主要途徑[3],與隔離、焚燒、填埋、化學(xué)氧化等方法相比,微生物處理法具有成本低、二次污染少等優(yōu)點(diǎn).

微生物是生物修復(fù)的執(zhí)行者,篩選高效的石油降解菌是重心.目前有研究以純烴(芴、芘等)為唯一碳源篩選出微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌[4]和芽孢桿菌屬[5],這些微生物能降解芴、芘、萘、菲、蒽等部分石油烴組分;袁紅莉等[6]從遼河渣油中分離出一些石油降解菌,如微桿菌屬、假單胞菌屬等,但是這些菌只能對原油中部分長鏈烷烴、環(huán)烷烴、少數(shù)芳烴成分如烷基萘系物具有降解作用,降解范圍較窄.目前對于重質(zhì)成分含量較高的稠油的降解(尤其是結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的萜族化合物、三環(huán)以上的多環(huán)芳烴成分)鮮見報道.本研究從大連保稅庫區(qū)污染土壤中分離出 1株高效稠油降解菌 DL1-G,對其進(jìn)行鑒定,并探討了其對稠油及稠油不同組分的降解特性,以期為稠油污染的生物修復(fù)提供理論依據(jù)與技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 采自大連保稅庫區(qū)稠油污染園區(qū),pH 值為6～6.5、含水率 0.003%、含油率0.37%、總有機(jī)質(zhì)含量6.087g/kg.

1.1.2 原油 采自大連新港溢油事故區(qū)域,送至中國石油化工股份有限公司石油化工科學(xué)研究院測定其動力黏度為1196mPa?s,相對密度為0.976g/cm3,根據(jù)中國稠油分類標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)所用原油為普通稠油.采用SY/T5119-1995石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[7]規(guī)定的氧化鋁吸附柱層析法確定稠油族組分組成及含量分別為:飽和烴 37.51%±0.08%,芳香烴 33.58%±0.90%,瀝青質(zhì) 9.84%±1.66%,非烴 15.93%±0.41%.

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)無機(jī)鹽培養(yǎng)基:KH2PO41.0g、K2HPO4·3H2O 2.5g、NaNO32.0g、NH4Cl 1.0g、MgSO4·7H2O 0.25g、CaCl20.01g、FeSO4·7H2O 0.01g、CuSO4·5H2O 0.01g、MnSO4·H2O 0.01g、NaCl 10.0g、去離子水1000mL, pH=6.5. (2)含油固體培養(yǎng)基:在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中加 1.4%瓊脂(m/V),待培養(yǎng)基冷卻后,取稠油均勻平鋪其表面.(3)LB固體培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、NaCl 5.0g、瓊脂20.0g、去離子水1000mL,pH=7.0.

1.2 稠油降解菌的富集、分離與復(fù)篩

取 10%土樣(m/V)加到以稠油為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,180r/min、30℃培養(yǎng) 7d,取 5%富集液(V/V)轉(zhuǎn)到含油量為1%(m/V)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng),如此連續(xù)富集3次.吸取終富集液稀釋涂布到含油固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng) 10d,觀察到培養(yǎng)基上石油層變薄且出現(xiàn)透明圈,挑取透明圈處菌落,轉(zhuǎn)接到LB固體培養(yǎng)基上,多次劃線純化,分離出單菌落.

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)及生理生化特性分析 通過平板方法觀察菌落形態(tài)、光學(xué)顯微鏡結(jié)合結(jié)晶紫染色法觀察菌體形態(tài),并結(jié)合BIOLOG檢測菌株生理生化特性[8],對分離到的DL1-G菌株進(jìn)行鑒定.

1.3.2 16S rRNA 基因序列分析 (1)提取純培養(yǎng)菌株基因組DNA[9];(2)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因[10]:以27F和1492R為引物,PCR擴(kuò)增16SrRNA序列,獲得約1.5kb的產(chǎn)物.具體PCR反應(yīng)體系如下:1μL100倍稀釋DNA模板,10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL,25mmol/LdNTP混合溶液 4μL,20pmol/L引物27F1μL,20pmol/L引物1492R1μL,Taq 酶(5U/μL)0.25μL,加滅菌去離子水至總體積為50μL.PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,35個循環(huán),然后72℃延15min;30℃3min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測. (3)16S rRNA基因序列測定:純化后的PCR產(chǎn)物送至博邁德測序公司進(jìn)行序列測定,兩個反應(yīng)雙向測通,用ContigExpress進(jìn)行雙向序列拼接. (4)序列同源性分析:序列信息輸入EzTaxon Server 2.1數(shù)據(jù)庫與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行同源性比對,利用軟件MEGA4.l,選擇neighbor-joining方式,Kimura 2-parameter模型,自展1000次,構(gòu)建發(fā)育樹.

1.4 降解特性分析

接種5%(m/V)菌株DL1-G于含油0.1%的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,180r/min、30℃培養(yǎng)9d,采用二氯甲烷萃取殘油,利用氧化鋁吸附柱層析法分析DL1-G菌降解前后的稠油族組分(飽和烴、芳香烴、瀝青質(zhì)和非烴)含量變化,根據(jù)稠油降解前后質(zhì)量計算稠油降解率[11].該組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行.

收集氧化鋁層析柱分離出的飽和烴和芳香烴,采用Agilent 6890-5975c氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀加內(nèi)標(biāo)法對飽和烴、芳香烴成分進(jìn)行分析,烷烴內(nèi)標(biāo)為氘代正構(gòu)二十四烷,芳香烴內(nèi)標(biāo)為氘代二苯并噻吩.具體測試條件:色譜載氣:99.999%氦氣;進(jìn)樣口:300℃;傳輸線:280℃;色譜柱:HP-5MS彈性石英毛細(xì)柱(60m×0.25mm×0.25μm);升溫程序:50℃保持1min;再以15℃/min升至120℃,以30℃/min升至300℃,保持25min;載氣流速:1mL/min.質(zhì)譜EI源,絕對電壓1047V;全掃描和離子掃描同步進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 稠油高效降解菌DL1-G的篩選與形態(tài)特征

從大連保稅庫區(qū)污染土壤中富集分離出一株稠油高效降解菌(命名 DL1-G),在篩選培養(yǎng)過程中,稠油被分散成細(xì)小油滴,培養(yǎng)液表面未出現(xiàn)連成片的油膜,溶液濃稠、呈深褐色.石油烴被乳化分散成小油滴,增大了油水接觸面積,有利于微生物攝取代謝[12].

用LB固體培養(yǎng)基對菌株DL1-G的形態(tài)進(jìn)行觀察,菌落顏色為米白色,圓形,稍微隆起,濕潤光滑,無熒光,不透明,邊緣整齊略帶微小毛刺;光學(xué)顯微鏡觀察該菌株細(xì)胞形態(tài)為桿狀,橢圓型芽孢中生.

2.2 菌株DL1-G鑒定分析

2.2.1 生理生化鑒定分析基于微生物利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中的顏色變化,用BIOLOG全自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株DL1-G進(jìn)行鑒定分析,結(jié)果顯示該菌株與Bacillus flexus相似性最高,屬于好氧型革蘭陽性細(xì)菌.具體碳源利用情況見表1.

表1 DL1-G菌對不同碳源利用情況Table 1 The utilization of different carbon sources by strain DL1-G

2.2.2 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建將16S rRNA基因序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果顯示與菌株DL1-G同源相似性大于98%的都是Bacillus屬菌株,結(jié)合生理生化特點(diǎn),推斷該菌株屬于芽孢桿菌屬Bacillus sp..其中與DL1-G相似性最高的菌株是 Bacillus flexus(100%,登錄號:AB021185),其次為Bacillus aryabhattai(98.927%,登錄號:EF114313)和Bacillus megaterium(98.927%,登錄號:D16273).

基于neighbour-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),菌株 DL1-G與菌株 Bacillus flexus、Bacillus aryabhattai、Bacillus megaterium等同源性＞95%的15個芽孢桿菌屬的菌種共同構(gòu)成連貫的集群,菌株DL1-G與Bacillus flexus位于同一發(fā)育分支.自1989年被報道以來, Bacillus flexus被發(fā)現(xiàn)對硝基苯、鄰硝基甲苯、3-硝基苯、4-硝基苯的降解能力[13],未見有關(guān)其降解石油烴的報道.

2.3 稠油高效降解菌DL1-G的降解特性

2.3.1 總烴及族組分分析 重量法測定菌株DL1-G 9d對稠油(飽和烴37.58%,芳烴32.68%)的降解率達(dá)39.89%+1.43%;與史繼誠等[14]報道的假單胞菌對沙特油田重質(zhì)油(飽和烴 81.24%,芳烴12.49%)18d降解率42.8%相當(dāng),也與何麗媛等[15]報道的4株單菌對奧斯柏格輕質(zhì)油的降解率相當(dāng)(單菌及其降解率分別為洋蔥伯克霍爾德氏菌40.23%、鞘氨醇單胞菌42.2%、假單胞菌48.45%、Pandoraea pnomenusa 30.52%).本實(shí)驗(yàn)原油為稠油,其飽和烴含量較低,而芳香烴等重質(zhì)成分含量較高,因此,菌株 DL1-G對稠油具有較好的降解潛力.

對DL1-G菌降解前后稠油進(jìn)行族組成分析,結(jié)果見表2.稠油經(jīng)菌株DL1-G作用后,飽和烴、芳香烴含量明顯降低,分別降低67.40%、69.29%,二者含量總和與降解前相比降低了68.30%,而非烴、瀝青質(zhì)的含量有所增加.可見,降解前后稠油族組分波動較大,這顯示了菌株DL1-G對稠油中不同組分的代謝利用具有選擇性[16].對于菌作用后非烴、瀝青質(zhì)含量增加的現(xiàn)象,可能是微生物代謝過程中產(chǎn)生了大量高碳有機(jī)酸等非烴類物質(zhì)所致[17-18].

圖1 基于16S rRNA序列建立的DL1-G菌與相關(guān)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1pHylogenetic tree of strain DL1-G and the related strains based on 16S rRNA gene sequence

表2 降解前后稠油族組分含量變化Table2 The variation in proportion of group compositions in heavy oil before and after the degradation by strain DL1-G

2.3.2 飽和烴和芳香烴組成分析 進(jìn)一步確定DL1-G菌作用下飽和烴和芳香烴具體組成的變化,將族組分分離得到的飽和烴與芳香烴進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析,用內(nèi)標(biāo)法計算降解前后稠油中各烴組分的含量.

圖2 降解前、后飽和烴總離子流譜Fig.2 The spectra of saturated hydrocarbons before and after the degradation by strain DL1-G

飽和烴組分分析:由GC-MS結(jié)果分析可知(圖2),飽和烴經(jīng)DL1-G菌作用后,組成及含量發(fā)生較大變化(表 3 ).保留時間 34min之前的峰全部消失,飽和烴降解了 95.75%,其中,nC11～nC38、nC6～nC30-烷基環(huán)已烷及姥鮫烷(27.179min)、植烷(30.657min)均未檢出,C14～C16二環(huán)倍半萜烷降解率達(dá)99.38%,8α(H)-補(bǔ)身烷、8β(H)-補(bǔ)身烷、8β(H)-升補(bǔ)身烷降解率達(dá)99.59%,13β(H),14α(H)-C19～C29三環(huán)萜烷降解率達(dá)36.32%,11種甾烷類化合物(表4)降解率達(dá) 12.04%,而未見藿烷類化合物有明顯的降解.可見,菌株 DL1-G不僅對正構(gòu)烷烴有較好的降解效果,而且對結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的環(huán)烷烴、萜族化合物也有降解效果,但對不同化合物的降解能力不同,為正構(gòu)烷烴、環(huán)烷烴、類異戊二烯烴、二環(huán)倍半萜烷、補(bǔ)身烷＞三環(huán)萜烷、甾烷＞藿烷,與包建平等[19]的研究結(jié)果(補(bǔ)身烷＞甾烷＞藿烷系列＞三環(huán)萜烷、四環(huán)萜烷和伽馬蠟烷)一致.對于姥鮫烷等難降解的生物標(biāo)志物,菌株DL1-G也表現(xiàn)出較好的降解作用,這可能是由于稠油中的正構(gòu)烷烴的含量較低,使得微生物從培養(yǎng)初期就大量利用重質(zhì)成分[20],導(dǎo)致其含量不斷降低;已有研究表明[21-24],在不同環(huán)境條件下,包括姥鮫烷、植烷、霍烷、甾烷在內(nèi)的多種生物標(biāo)志物能被微生物降解利用.

表3 菌株DL1-G作用前后飽和烴組成及相對含量變化(μg/mg)Table 3 The changes in the relative contents of saturated hydrocarbons under the action of strain DL1-G(μg/mg)

由 GC-MS分析結(jié)果可知(圖3),芳香烴經(jīng)DL1-G作用后,烴組分的相對含量發(fā)生了很大變化(圖4).保留時間44min之前的峰幾乎全部消失,萘系物、芴系物、二苯并噻吩系物、菲系物等化合物占總檢出物的85.68%,其總降解率為81.62%,單個物質(zhì)的降解率分別為98.61%、98.34%、93.01%、72.83%;蒽、聯(lián)苯系物、二苯并呋喃系物、螢蒽、芘、苯并[a]芴、苯并[b]熒蒽、苯并[b]芴、甲基芘系物、苯并[a]蒽及苯并[k]熒蒽占總檢出物的7.45%,其總降解率為53.28%,單個物質(zhì)的降解率分別為98.55%、89.55%、83.42%、73.78%、64.85%、51.38%、50.27%、42.45%、29.23%、25.25%、10.03%.可見菌株 DL1-G對多種芳烴組分都有降解能力,但對不同化合物的降解具有選擇性,使得降解率出現(xiàn)差異,如圖4所示,化合物分子量與降解率總體成負(fù)相關(guān),低分子量化合物優(yōu)先被降解.從圖4中還可以看出,菌株DL1-G對分子量較大的苯并[b]熒蒽的降解率也較好,說明芳香烴的可降解性還與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān).

圖3 降解前、后芳烴總離子流譜Fig.3 The spectra of aromatic hydrocarbons before and after the degradation by strain DL1-G

圖4 芳烴及多環(huán)芳烴組分相對含量變化及降解率Fig.4 Degradation rate and variation in the relative content of aromatic hydrocarbons and polycyclic aromatic hydrocarbons

本研究篩選的降解菌DL1-G對16種USEPA優(yōu)控多環(huán)芳烴中的多種成分都有較好的降解效果(圖4b),其對蒽、菲、芴、芘、萘降解率均達(dá)到60%以上,分別為98.55%、97.16%、82.98%、64.85%、63.61%.由此可見,菌株DL1-G對多環(huán)芳烴的降解范圍較大、降解效果較好,而且降解過程克服了稠油中其他復(fù)雜成分的影響,具有較好的應(yīng)用前景.

3 結(jié)論

3.1 研究篩選出一株具有較好稠油降解能力的菌株DL1-G,鑒定為彎曲芽孢桿菌.9d內(nèi)菌株DL1-G對稠油的降解率達(dá)39.89%.

3.2 菌株 DL1-G不僅對正構(gòu)烷烴有較好的降解效果,而且對結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的環(huán)烷烴和萜族化合物降解效果也較好,飽和烴中nC11～nC38、nC6～nC30-烷基環(huán)已烷、姥鮫烷、植烷及部分萜族化合物幾乎被完全降解.

3.3 菌株 DL1-G對芳烴降解能力較高,其中萘系物、芴系物、二苯并噻吩系物、菲系物、聯(lián)苯系物等組分的降解率均達(dá)到70%以上;對16種多環(huán)芳烴中的萘、芴、蒽、菲、芘的降解率均達(dá)60%以上,對苯并[b]熒蒽也有較好的降解效果,降解率達(dá)50.27%.

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