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    CXCL12和CXCR4在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義*

    2012-01-06 08:03:43劉海巍陶勝忠牛光明牛國策孫所輝
    重慶醫(yī)學(xué) 2012年19期
    關(guān)鍵詞:星形膠質(zhì)瘤染色

    劉海巍,陶勝忠,牛光明,周 興,牛國策,孫所輝

    (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,鄭州 450014)

    星形細(xì)胞瘤是最常見的神經(jīng)上皮性腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的13.0%~26.0%,占膠質(zhì)瘤的21.2%~51.6%[1]。目前以手術(shù)治療為主,輔以放療、化療等的綜合治療,雖然取得了一定的臨床效果,但并未從根本上提高星形細(xì)胞瘤患者的總體預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12及其受體CXCR4構(gòu)成的CXCL12/CXCR4信號(hào)通路可能與人膠質(zhì)細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),本文初步探討CXCL12和CXCR4在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義。

    1 材料與方法

    1.1材料 選取本院神經(jīng)外科2010年3月至2011年7月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為星形細(xì)胞瘤標(biāo)本48例(腫瘤組)。所有患者手術(shù)前均未經(jīng)放療、化療等治療。其中男31例,女17例;年齡7~68歲,平均41.7歲。根據(jù)2007年WHO關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分級(jí),Ⅰ級(jí)8例,Ⅱ級(jí)17例,Ⅲ級(jí)16例,Ⅳ級(jí)7例。12例非瘤組織均取自顱腦損傷等行減壓術(shù)患者(非瘤組)。標(biāo)本離體30 min內(nèi)迅速放入液氮罐中,后轉(zhuǎn)入―80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse transcription polym-erase chain reaction,RT-PCR)半定量檢測(cè)CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 CXCL12引物:上游5′-TAG TGC CTC CAT GGC ATA CA- 3 ′,下游5′-GAT GTG TAA TGG TCC CCC TG-3 ′,擴(kuò)增片段長度為138 bp;CXCR4引物:上游5′-TGA CTC CAT GAA GGA ACC CTG-3′,下游5′- CTT GGC CTC TGA CTG TTG GTG-3′,擴(kuò)增片段長度381 bp;內(nèi)參β-actin:上游5′-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A- 3′,下游5′-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA -3′,擴(kuò)增片段長度為318 bp。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后攝像,采用相對(duì)積分光密度(RIOD)表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所用的引物及β-actin均購自鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司。

    1.3免疫組化SP法檢測(cè)CXCL12蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)水平 采用免疫組化SP法檢測(cè)CXCL12和 CXCR4蛋白,兔抗人CXCL12多克隆抗體(Abcam公司),兔抗人CXCR4多克隆抗體(R&D 公司),免疫組化試劑盒(鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司)。判斷標(biāo)準(zhǔn):CXCL12和 CXCR4多表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜, 隨機(jī)選10個(gè)高倍視野,依照細(xì)胞著色密度和著色強(qiáng)度半定量評(píng)分。(1)染色細(xì)胞百分比:未見染色為0分,≤25%細(xì)胞染色為1分,25%~50%細(xì)胞染色為2分,<50%細(xì)胞染色為3分;(2)依陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度:未見染色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,上述兩者之和的總得分來判定結(jié)果, >2分定義為陽性表達(dá)(+), ≤2分定義為陰性表達(dá)(-)。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件包處理數(shù)據(jù),兩獨(dú)立定量樣本之間的比較用t檢驗(yàn),相關(guān)性用Pearson積矩相關(guān)系數(shù)表示。兩組分類變量之間的比較和相關(guān)性分析用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA的表達(dá) CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA在非瘤組和腫瘤組中的表達(dá)見表1,圖1、2。CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA在腫瘤組中的表達(dá)高于在非瘤組中的表達(dá)(P<0.05);在Ⅲ~Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于在Ⅰ~Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)(P<0.05)。Pearson積矩相關(guān)系數(shù)表明CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.697,P<0.05)。

    表1 CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA在各組患者中的表達(dá)情況

    △:P<0.05,與非瘤組比較;☆:P<0.05,與Ⅰ~Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織比較。

    M:Marker;Ⅰ:Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織;Ⅱ:Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織;Ⅲ:Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織;Ⅳ:Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織。

    圖1 CXCL12 mRNA電泳圖

    表2 CXCL12蛋白和CXCR4蛋白在各組中的表達(dá)情況

    △:P<0.05,與非瘤組比較;☆:P<0.05,與Ⅰ~Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織比較。

    2.2CXCL12蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá) 見表2。CXCL12蛋白和CXCR4蛋白在腫瘤組中的表達(dá)高于非瘤組的表達(dá)(P<0.05)。CXCL12蛋白和CXCR4蛋白在Ⅲ~Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)高于在Ⅰ~Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)(P<0.05)。且CXCL12蛋白和CXCR4蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.499,P<0.05)。

    M:Marker;Ⅰ:Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織;Ⅱ:Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織;Ⅲ:Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織;Ⅳ:Ⅳ級(jí)星形細(xì)胞瘤組織。

    圖2 CXCR4 mRNA電泳圖

    3 討 論

    CXCL12 屬于趨化因子CXC亞家族,首先在P6系小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中被發(fā)現(xiàn),CXCR4是存在于胞膜上的具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白藕聯(lián)受體。CXCL12與CXCR4具有高度的親和力,CXCL12與CXCR4的N端特異性結(jié)合并與CXCR4第 2胞外環(huán)相互作用才能啟動(dòng)下游信號(hào),啟動(dòng)基因表達(dá)和細(xì)胞周期進(jìn)程的改變,引起趨化性、細(xì)胞增殖和基因轉(zhuǎn)錄等多種反應(yīng)。

    本研究檢測(cè)了CXCL12和CXCR4在非瘤腦組織和星形細(xì)胞瘤各病理級(jí)別組織中的表達(dá),結(jié)果顯示CXCL12和CXCR4在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯高于在非瘤腦組織中的表達(dá),它們的表達(dá)水平隨星形細(xì)胞瘤病理級(jí)別的升高而升高,并且二者的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。這些表明CXCL12和CXCR4構(gòu)成的CXCL12/CXCR4信號(hào)通路與星形細(xì)胞瘤的惡性發(fā)展和惡性程度均有密切的關(guān)系,可能是星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展進(jìn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

    Barbero等[2]發(fā)現(xiàn)外源性的CXCL12能誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,其機(jī)制可能與ERK的活化相聯(lián)系,并且CXCL12 能誘導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等遷移到腫瘤組織,這些細(xì)胞不但參與了腫瘤環(huán)境的炎癥和免疫反應(yīng),還能產(chǎn)生多種生物因子刺激腫瘤的生長,并通過產(chǎn)生促血管生成因子刺激血管的生成從而促進(jìn)腫瘤的增殖。CXCL12還能通過激活核因子-κB(NF-κB)來抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的產(chǎn)生和腫瘤細(xì)胞的凋亡間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)表明高級(jí)別膠質(zhì)瘤中CXCL12和CXCR4的表達(dá)較低級(jí)別膠質(zhì)瘤及正常腦組織均明顯升高。CXCL12是不具有谷氨酰胺-亮氨酸-精氨酸序列的趨化因子,但卻顯示較強(qiáng)出血管生成的活性。體內(nèi)病理濃度的CXCL12在伴有低濃度的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的情況下能有效誘導(dǎo)血管的生成[3],這揭示了它們之間存在巨大的協(xié)同作用,其機(jī)制可能與CXCL12和 CXCR4 結(jié)合后通過 PI3K/Akt途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放 VEGF有關(guān)。此外,CXCL12能吸引樹突狀細(xì)胞進(jìn)入腫瘤環(huán)境,然后腫瘤樹突狀細(xì)胞可依次通過產(chǎn)生IL-8和TNF-α誘導(dǎo)血管的生成[4]。同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移行在很大程度上依賴于CXCL12,血管內(nèi)皮細(xì)胞可沿著CXCL12遷移并以依賴CXCL12的方式誘導(dǎo)腫瘤血管的生成。CXCL12 還可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)抑制纖溶酶原激活物(PA)來發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤增殖和血管發(fā)生的作用[5]。研究還顯示,在CXCL12抗體存在的情況下非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的轉(zhuǎn)移在很大程度上被抑制了[6],并且在細(xì)胞表面阻斷CXCR4的表達(dá)能極大降低腫瘤細(xì)胞向肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移,在腫瘤經(jīng)常轉(zhuǎn)移的器官如淋巴結(jié)、肺臟、肝臟和骨髓等中發(fā)現(xiàn)表達(dá)有較高水平的CXCL12[7]。腫瘤的散播可以被看為涉及細(xì)胞外基質(zhì)降解的過程,金屬蛋白酶(MMPs)能使周圍正常組織的細(xì)胞外基質(zhì)降解并能介導(dǎo)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。許多研究證實(shí),在多種腫瘤細(xì)胞中CXCL12能誘導(dǎo)MMPs的合成和腫瘤細(xì)胞的粘附來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[8]。CXCL12和CXCR4在一些腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)也許暗示著CXCL12/CXCR4信號(hào)通路在引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向特定器官的轉(zhuǎn)移中方面發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。

    目前通過阻斷CXCL12和CXCR4的相互作用和抑制下游細(xì)胞內(nèi)酶的活性,CXCL12/CXCR4信號(hào)通路已成為相關(guān)疾病治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。CXCR4拮抗劑——AMD3100的安全性、耐受性和有效性在臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)[9]。臨床試驗(yàn)顯示非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者在應(yīng)用AMD3100和G-CSF后與單獨(dú)應(yīng)用G-CSF相比,更多的患者收集到了最佳數(shù)量的干細(xì)胞用于自體移植[10]。CXCL12拮抗劑類似物CTCE-9908在小鼠的乳腺癌模型中能降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤的生長,并能在小鼠的前列腺癌模型中減小腫瘤的體積[11]。

    本研究認(rèn)為在星形細(xì)胞瘤中存在CXCL12和CXCR4的高表達(dá),其表達(dá)水平與病理級(jí)別密切聯(lián)系,并且二者的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。檢測(cè)CXCL12和CXCR4的表達(dá)水平可能對(duì)臨床治療和判斷星形細(xì)胞瘤病理級(jí)別、分化程度及預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

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