Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化胸腺五肽脂質(zhì)體的處方工藝

張 冕，王德堂，劉 娥

(荊楚理工學(xué)院1．化工與藥學(xué)院，2．醫(yī)學(xué)院，湖北 荊門 448000)

Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化胸腺五肽脂質(zhì)體的處方工藝

張 冕1，王德堂2，劉 娥1

(荊楚理工學(xué)院1．化工與藥學(xué)院，2．醫(yī)學(xué)院，湖北 荊門 448000)

目的 優(yōu)化胸腺五肽脂質(zhì)體的處方工藝。方法 采用三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面法對(duì)影響胸腺五肽脂質(zhì)體包封率的主要因素進(jìn)行考察，以包封率為響應(yīng)值，建立相應(yīng)的二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型優(yōu)化處方。結(jié)果 最優(yōu)處方是脂質(zhì)體膜材料中磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為17∶5，磷脂與藥物的質(zhì)量比為17∶2，有機(jī)相與水相的體積比為3∶1。包封率的預(yù)測(cè)值與理論值偏差較小。結(jié)論 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法可用于胸腺五肽脂質(zhì)體處方的優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化的處方工藝穩(wěn)定可行。

胸腺五肽;脂質(zhì)體;響應(yīng)面法;Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)是采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程進(jìn)行分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種用于開發(fā)、改進(jìn)、優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)和數(shù)學(xué)方法。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是響應(yīng)面法的一種，它可以提供3到10個(gè)因素，進(jìn)行低、中、高三水平的的二階實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，評(píng)價(jià)因素和指標(biāo)間的非線性關(guān)系，與常采用的正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)相比，具有預(yù)測(cè)性好、精度高、直觀、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，目前已較多地用于藥物處方篩選、劑型制備過程、生物過程以及化學(xué)合成過程的優(yōu)化［1-2］。

胸腺五肽(thymopentin，Tp5)在臨床上廣泛用于慢性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤及嚴(yán)重感染等疾病的治療［3］，但Tp5易被蛋白酶和氨肽酶降解為氨基酸，若將Tp5制成脂質(zhì)體，可避免酶降解，提高其穩(wěn)定性和生物利用度。

本研究在我們前期對(duì)Tp5脂質(zhì)體制備工藝研究的基礎(chǔ)上［4］，嘗試選取Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)影響Tp5脂質(zhì)體制備的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而篩選脂質(zhì)體的最佳處方。

1 材料

Tp5對(duì)照品(上海信然生物技術(shù)有限公司，批號(hào):140728，含量99．17%);Tp5(杭州中肽生化有限公司，批號(hào):091019，含量:97．16%);大豆磷脂(廣州市海圣生物科技有限公司，批號(hào):081220);膽固醇(上海政翔化學(xué)制劑研究所，批號(hào):08322);甲醇為色譜純;其余試劑均為分析純。

RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義予華儀器有限公司);UH-100A超聲波細(xì)胞粉碎儀(北京宏昌信科技有限公司);CS150NX超速離心機(jī)(日本Hitachi公司);Agilent1100高效液相儀(美國(guó)Agilent公司)。

2 方法與結(jié)果

2．1 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

脂質(zhì)體的制備、含量測(cè)定及包封率的測(cè)定方法見文獻(xiàn)［4-5］。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［6］，選取對(duì)脂質(zhì)體包封率影響較為顯著的3個(gè)因素，在3個(gè)水平上進(jìn)行優(yōu)化研究，以脂質(zhì)體的包封率為響應(yīng)值，建立數(shù)學(xué)模型。3個(gè)因素分別記作X1(磷脂與膽固醇質(zhì)量比)，X2(磷脂與Tp5質(zhì)量比)，X3(有機(jī)相與水相體積比)，每個(gè)因素的低、中、高三水平分別記作－1、0、+1，各因素水平見表 1，利用 Design Expert軟件建立的 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Tab．1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

2．2 二次回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

分別采用多元線性和多元二項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型回歸分析因素X1、X2、X3對(duì)響應(yīng)值Y的影響。多元線性模型回歸結(jié)果:Y=59．64+3．18 X1+0．89 X2－2．59 X3(R2=0．262 3);多元二項(xiàng)式模型回歸結(jié)果:Y=65．36+3．18 X1+0．89 X2－ 2．59 X3+0．67 X1X2－1．23 X1X3+4．55 X2X3－4．31 X12－6．23－1．63(R2=0．944 7)。

由上述方程可知，對(duì)于脂質(zhì)體的包封率，二次多項(xiàng)式的擬合度要好于多元線性模型。對(duì)該二項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行方差分析，見表3，結(jié)果顯示該模型方程具有極顯著性(P＜0．01)，失擬差不顯著(P＞0．05)，表明無失擬因素存在，對(duì)模型是有利的。因此，該模型可用于對(duì)Tp5脂質(zhì)體的包封率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Experimental results and values of responses for Box-Behnken design

表3 包封率回歸模型方差分析Tab．3 Variance analysis of regression model

2．3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化條件的確定

根據(jù)Design-Expert軟件繪制不同影響因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲線圖，見圖1。圖1為分別固定三個(gè)影響因素其中之一，考察其他兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的響應(yīng)曲面圖，該圖底部平面為等高線圖，等高線圖的重合區(qū)域用來進(jìn)行各影響因素的優(yōu)化。

圖1 各因素對(duì)包封率的響應(yīng)曲面圖Fig．1 Response surface plot of factors on entrapment efficiency

根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，得到優(yōu)化條件為:脂質(zhì)體膜材料中磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為17∶5，磷脂與藥物的質(zhì)量比為17∶2，有機(jī)相與水相的體積比為3∶1。為檢驗(yàn)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果的可靠性，根據(jù)上述優(yōu)化條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，制備3批樣品分別測(cè)定其包封率，理論值為67．9%，實(shí)測(cè)包封率的平均值為67．3%，RSD為1．6%，說明此模型是可靠的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)嘗試性采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化Tp5脂質(zhì)體的處方工藝，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到了Tp5脂質(zhì)體的包封率與磷脂膽固醇的質(zhì)量比、磷脂藥物的質(zhì)量比和有機(jī)相水相體積比三者之間關(guān)系的回歸模型，充分考慮到各因素的交互作用，設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)單，相關(guān)系數(shù)較高，處方條件經(jīng)過優(yōu)化后，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該處方工藝穩(wěn)定可行。

［1］ 隋允康，宇慧平．響應(yīng)面方法的改進(jìn)及其對(duì)工程優(yōu)化的應(yīng)用［M］．北京:科學(xué)出版社，2011．

［2］ 張 娜，周 衛(wèi)，王文溪，等．響應(yīng)面法優(yōu)化白囊粑齒菌中腺苷的提取工藝［J］．中國(guó)生化藥物雜志，2011，32(5):370-373．

［3］ 袁曉佳，張志榮，何 勤．胸腺五肽三甲基殼聚糖納米粒包封率的測(cè)定［J］．華西藥學(xué)雜志，2005，20(2):131-133．

［4］ 張 冕，羅 磊，萬 芳．胸腺五肽脂質(zhì)體的處方及制備工藝研究［J］．中國(guó)生化藥物雜志，2012，33(4):427-429．

［5］ 張 冕．超速離心-HPLC法測(cè)定胸腺五肽脂質(zhì)體的包封率［J］．荊楚理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27(2):12-14．

［6］ 郭 潔，洪子雯，方曉玲．Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化表阿霉素脂質(zhì)體的處方工藝［J］，復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，34(6):816-820．

Optimization of thymopentin liposome formulation by Box-Behnken experimental design

ZHANG Mian1，WANG De-tang2，LIU E1
(1．School of Chemical Engineering and Pharmacy，2．Medical School，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，China)

Purpose To optimize the formulation of thymopentin liposome．Methods The independent variables were investigated by using a three-factor，three-level Box-Behnken experimental design and response surface methodology．The response variable was encapsulation efficiency．The data were imitated using multi-linear equation and second-order polynomial equation．Results The optimized formulation was as follows:the quality rate of phospholipid and cholesterol was 17∶5，the quality rate of phospholipid and drug was 17∶2，the volume rate of organic phase and aqueous phase was 3∶1．Deviation between observed and predicted values were small．Conclusion The Box-Behnken experimental design is suitable for optimizing the formulation of thymopentin liposome．The optimized formulation is stable and feasible．

thymopentin;liposome;response surface methodology;Box-Behnken experimental design

R944．9;TQ460．6

A

1005-1678(2012)06-0808-03

2012-07-05

湖北省荊門市科技局引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目“胸腺五肽脂質(zhì)體工藝研究”(2007YDS37)

張 冕，女，講師，碩士，研究方向:藥物新劑型與制劑新技術(shù)，E-mail:mian416@163．com。