茶堿在正常及肝纖維化大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)

張懋璠，蔣昆諭，韓 龍，趙 妍，王 欣，孟勝男

(中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥劑教研室，遼寧 沈陽 110001)

茶堿在正常及肝纖維化大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)

張懋璠，蔣昆諭，韓 龍，趙 妍，王 欣，孟勝男

(中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 藥劑教研室，遼寧 沈陽 110001)

目的 比較茶堿在正常及肝纖維化大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)。方法 SD大鼠24只，分成4組:靜脈給藥正常組、靜脈給藥模型組、口服給藥正常組和口服給藥模型組，每組各6只，采用尾靜脈注射或灌胃方式給予茶堿5 mg/kg，用HPLC法測定茶堿血藥濃度，運(yùn)用DAS2．1．1擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 在口服和靜脈給藥條件下，茶堿的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-24h、AUC0-∞、CLz(或CLz/F)、MRT0-24h、MRT0-∞和t1/2z在正常鼠和肝纖維化鼠之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，Cmax，tmax，Vz(或Vz/F)的差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 茶堿在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)會(huì)受肝纖維化顯著影響。

茶堿;肝纖維化;大鼠;藥物動(dòng)力學(xué)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間過程，是各種肝疾病的共同病理基礎(chǔ)。HF作為一種臨床多發(fā)病癥，將導(dǎo)致肝血流量和肝藥酶活性的改變［1］，進(jìn)而引起藥物在機(jī)體內(nèi)過程的變化。

茶堿具有強(qiáng)心、利尿、松弛支氣管平滑肌和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，是臨床治療哮喘、肺氣腫、慢性支氣管炎的常用藥，因其治療窗狹窄［2］，臨床多使用其緩釋制劑，同時(shí)進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測。

有關(guān)茶堿的藥動(dòng)學(xué)研究或茶堿與臨床上一些常用藥物相互作用的藥動(dòng)學(xué)研究多見報(bào)道，但在一些病理?xiàng)l件下，尤其是可能會(huì)影響藥物代謝的HF條件下茶堿的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程是否發(fā)生改變尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對象，比較茶堿在正常大鼠和HF大鼠的藥動(dòng)學(xué)差異，研究結(jié)果可為臨床伴有HF的哮喘病人的合理用藥提供指導(dǎo)。

1 材料

茶堿(含量99．9%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);咖啡因(內(nèi)標(biāo)，含量98．0%，成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-11060102);甲醇為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司);大豆油為市售福臨門大豆油;其他試劑為分析純。

Waters2695高效液相色譜儀、Waters2489型紫外檢測器、Empower2色譜工作站(美國Waters公司)。

6～8周齡雄性SD大鼠，中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SYXK(遼)2008-0005。

2 方法與結(jié)果

2．1 HF模型的建立與分組

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均隨機(jī)分為正常組與HF模型組。HF模型的制備參照文獻(xiàn)［3］方法(其中橄欖油用大豆油代替)，模型組大鼠腹部皮下注射50%四氯化碳大豆油溶液0．2 mL/kg，每周2次，同時(shí)對正常組大鼠腹部皮下注射大豆油2 mL/kg，持續(xù)8周。全部大鼠在實(shí)驗(yàn)期間正常飲食飲水。最終從正常組和HF模型組中分別隨機(jī)選取HF模型鼠及正常鼠各12只，體重(220±20)g，分成4組:靜脈給藥正常組、靜脈給藥模型組、口服給藥正常組和口服給藥模型組，每組6只。

另行選取正常組及HF模型組大鼠肝臟進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，與正常大鼠(圖1A)相比，皮下注射50%四氯化碳8周后(圖1B)，大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞較大，邊界不清晰，多發(fā)生變性或壞死，細(xì)胞間多被炎癥組織浸潤。中央靜脈缺失，纖維組織增生，并分割、包繞肝小葉，假小葉生成，肝臟出現(xiàn)明顯纖維化病理改變。

圖1 正常大鼠(A)和HF模型大鼠(B)肝組織病理切片(HE×200)Fig．1 Pathological sections of normal rats(A)and HF model rats(B)(HE stain×200)

2．2 茶堿的測定

2．2．1 色譜條件 色譜柱:Ecosil C18柱(250 mm×4．6 mm，5 μm);柱溫:35 ℃;檢測波長:274 nm;進(jìn)樣量20 μL;流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為10%甲醇溶液，線性梯度洗脫:0～2 min，0%A;2～8 min，0% ～12%A;8～16 min，12% ～28%A;16～18 min，28% ～33%A;18 ～20 min，33% ～88%A;20～23 min，88% ～0%A;23 ～25 min，0%A;流速1．0 mL/min。

2．2．2 血漿樣品處理 取血漿100 μL置于1．5 mL 離心管中，依次加入甲醇10 μL，50 μmol/L 內(nèi)標(biāo)溶液 20 μL，飽和硫酸銨溶液 200 μL，渦旋震蕩1 min，加入二氯甲烷 500 μL，渦旋震蕩 1 min，15 000 r/min離心5 min，取下層有機(jī)相450 μL于另一離心管中。再次加入二氯甲烷500 μL，渦旋震蕩1 min，15 000 r/min離心5 min，取下層有機(jī)相500 μL，與第一次的有機(jī)相合并，40℃氮?dú)饬鞔蹈?，加入甲?100 μL，渦旋震蕩 1 min，15 000 r/min 離心5 min，取20 μL 進(jìn)樣分析。

2．2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以濃度為 1 000，500，200，100，50．0，20．0，10．0，5．0，2．0 μmol/L 的茶堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL 代替甲醇 10 μL，按 2．2．2 項(xiàng)下方法操作。以茶堿與咖啡因(內(nèi)標(biāo))峰面積之比(Y)對茶堿濃度(X)用加權(quán)最小二乘法回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0．071 1 X+0．010 0，r=0．999 9(n=3)，線性范圍 0．2 ～100 μmol/L。

2．3 給藥方法與血樣采集

動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，當(dāng)日上午8時(shí)給予茶堿5 mg/kg(給藥前用生理鹽水配成2 mg/mL溶液)，其中口服給藥組采用灌胃給藥，靜脈給藥組采用尾靜脈注射給藥，2 h后自由飲水，4 h后自由飲食?？诜o藥組于給藥前及給藥后 0．25，0．5，1，1．5，2，3，4，6，8，12，24 h 采集眼眶靜脈血 0．5 mL，靜脈給藥組于給藥前及給藥后 0．083，0．25，0．5，0．75，1，2，3，4，6，8，12，24 h 采集眼眶靜脈血 0．5 mL，肝素抗凝，離心分離血漿，－40℃冷凍保存至測定。

2．4 血藥濃度數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

正常組和模型組給予茶堿5 mg/kg后平均藥時(shí)曲線見圖2～3，藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用 DAS2．1．1軟件處理，以統(tǒng)計(jì)矩模型擬合并得到主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中AUC用梯形法計(jì)算，Cmax和tmax為實(shí)測值。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(tmax、t1/2z、MRT用 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)、其他參數(shù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))結(jié)果見表1～2。

圖2 正常及HF大鼠灌胃茶堿5 mg/kg后的平均藥時(shí)曲線(n=6)Fig．2 Mean plasma concentration-time curves of normal and hepatic fibrosis rats after gavage administration of theophylline 5 mg/kg(n=6)

圖3 正常大鼠及HF大鼠尾靜脈注射茶堿(5 mg/kg)平均藥時(shí)曲線(n=6)Fig．3 Mean plasma concentration-time curves of normal and hepatic fibrosis rats after administration of theophylline 5 mg/kg by tail intravenous injection(n=6)

表1 正常及HF大鼠灌胃茶堿5 mg/kg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)Tab．1 Pharmacokinetic parameters in normal and hepatic fibrosis rats after gavage administration of theophylline 5 mg/kg(n=6)

3 討論

為了提高茶堿檢測靈敏度，本研究采用蛋白沉淀和液-液萃取相結(jié)合的方法處理血漿樣品，用甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果方法定量下限達(dá)到0．2 μmol/L，相當(dāng)于質(zhì)量濃度 0．036 μg/mL，方法靈敏度高于目前國內(nèi)外的報(bào)道［4-8］。我們進(jìn)行了方法專屬性試驗(yàn)，結(jié)果表明，空白血漿、內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾;穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，茶堿血漿樣品分別在室溫放置4 h，－40℃冷凍放置30 d和反復(fù)凍融3次對茶堿含量無影響;回收率、精密度等均符合要求。

表2 正常及HF大鼠尾靜脈注射茶堿5 mg/kg后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)Tab．2 Pharmacokinetic parameters in normal and hepatic fibrosis rats after administration of theophylline 5 mg/kg by tail intravenous injection(n=6)

研究結(jié)果表明，茶堿的一些主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，包括 CLz(或 CLz/F)、AUC0-24h、AUC0-∞、MRT0-24h及MRT0-∞等會(huì)受到HF的影響。其中，HF組相較正常組 AUC0-t、AUC0-∞、MRT0-t、MRT0-∞及 t1/2z增大，CLz(或CLz/F)減小，說明HF使茶堿代謝速度降低。此結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道的HF會(huì)影響CYP1A2等茶堿在大鼠體內(nèi)的相關(guān)代謝酶活性的結(jié)論［9］一致。此外，HF對茶堿的另外一些主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，包括Cmax，tmax，Vz(或Vz/F)等，無顯著影響，說明 HF病理狀態(tài)，可能不會(huì)對茶堿的吸收、分布造成顯著影響。

將正常大鼠AUC0-∞數(shù)據(jù)代入公式F=AUCpo/AUCiv，可推算出正常大鼠對茶堿的絕對生物利用度F約為93%，符合人們對于茶堿高生物利用度的認(rèn)知。采用同樣方法，也可推算出HF模型鼠對茶堿的絕對生物利用度約98%。雖然HF模型鼠對茶堿的絕對生物利用度高于正常鼠，但因?yàn)樵贖F條件下茶堿的AUCpo和AUCiv同時(shí)增大，故尚不能認(rèn)為HF對茶堿在大鼠體內(nèi)的口服吸收程度無影響。

本文研究結(jié)果顯示，茶堿在正常大鼠和HF大鼠的某些藥動(dòng)學(xué)參數(shù)存在顯著差異。提示臨床上伴有HF的哮喘患者應(yīng)用茶堿時(shí)，應(yīng)注意茶堿血藥濃度的檢測，調(diào)整用藥方案，以保證茶堿用藥的安全性和有效性。

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Pharmacokinetic of theophylline in normal and hepatic fibrosis rats

ZHANG Mao-fan，JIANG Kun-yu，HAN Long，ZHAO Yan，WANG Xin，MENG Sheng-nan
(Pharmaceutics Department，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110001，China)

Purpose To compare the pharmacokinetics of theophylline in normal and hepatic fibrosis rats．Methods Twenty-four Spraque-Dawley rats were divided into four groups(normal group with intravenous injection，hepatic fibrosis group with intravenous injection，normal group with gavage administration and hepatic fibrosis group with gavage administration)of which each got six rats and they were administrated with theophylline 5 mg/kg via gavage or tail intravenous injection．The concentration of theophylline in plasma was determined by HPLC method．The pharmacokinetic parameters were fitted by DAS2．1．1 software and statistically analyzed by SPSS13．0 software．Results There was significant difference between normal group and hepatic fibrosis group in pharmacokinetic parameters of AUC0-24h，AUC0-∞，CLz(or CLz/F)，MRT0-24h，MRT0-∞and t1/2z(P ＜0．05)under the condition of gavage and intravenous injection．There were no significant differences between normal group and hepatic fibrosis group in pharmacokinetic parameters of Cmax，tmax，Vz(or Vz/F)(P ＞0．05)．Conclusion The metabolism of theophylline in rats was significantly affected by hepatic fibrosis．

theophylline;hepatic fibrosis;rats;pharmacokinetics

R969．1

A

1005-1678(2012)06-0747-03

2012-04-20

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào):81173123)

張懋璠，男，碩士研究生，主要從事藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)的研究，E-mail:zhangmaofan@foxmail．com;孟勝男，女，通信作者，教授，Tel:024-23256666-5467，E-mail:shengnanmeng@yahoo．com．cn。