舟山眼鏡蛇毒蕈堿樣多肽MP的部分理化性質(zhì)測(cè)定

黃立峰，俞昌喜

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 藥學(xué)科，福建 福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350004)

舟山眼鏡蛇毒蕈堿樣多肽MP的部分理化性質(zhì)測(cè)定

黃立峰1，俞昌喜2

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 藥學(xué)科，福建 福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350004)

目的 對(duì)舟山眼鏡蛇毒蕈堿樣多肽MP成分進(jìn)行純化及部分理化性質(zhì)測(cè)定。方法 采用色譜技術(shù)純化蛇毒MP成分，質(zhì)譜儀測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr);Edman降解法分析部分氨基酸序列，與已知成分比對(duì);以卵磷脂為底物測(cè)定MP組分的磷脂酶A2活性;采用Bliss法測(cè)定MP對(duì)小鼠的急性毒性。結(jié)果 MP的Mr為13 260，其N端16位氨基酸序列為NLYQFKNMIQCTVPSR，與已知蛇毒磷脂酶A2基本一致，并具有較強(qiáng)的磷脂酶A2活性;腹腔注射MP對(duì)小鼠的LD50值為14.3 mg/kg。結(jié)論 MP為一種眼鏡蛇毒磷脂酶A2。

眼鏡蛇毒;毒蕈堿樣多肽;磷脂酶A2;理化性質(zhì)

非洲綠唇曼巴蛇(Dendroaspis angusticeps)毒液中含有一種能選擇性激動(dòng)M1膽堿受體的MTs(muscarinic toxins)成分，被證明能顯著改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙，具有開發(fā)為神經(jīng)退行性病變治療新藥的潛力［1］。隨后 Miyoshi等［2-3］從曼巴蛇以外蛇種毒液中分離到類似MTs作用的蛇毒磷脂酶A2成分MIs(muscarinic inhibitors)，其理化性質(zhì)與MTs差別較大。本課題前期從我國(guó)舟山眼鏡蛇毒液中也分離到一種能與M膽堿受體高度親和，并能激動(dòng)豚鼠回腸M膽堿受體的成分，作用類似MTs及MIs，暫命為毒蕈堿樣多肽(muscarinic peptide，MP)［4］。為明確MP性質(zhì)及進(jìn)行深入研究的需要，本文對(duì)MP進(jìn)行純化，并測(cè)定其相關(guān)理化性質(zhì)。

1 材料

MP 成分系本課題組前期通過色譜柱色譜法從舟山眼鏡蛇(Naja atra)毒液中分離獲得［4］;卵磷脂購(gòu)自上海試劑總廠。

Poros? CM 4.6/100離子交換色譜柱，美國(guó)Applied Biosystems公司;SOURCE?5RPC ST4.6/100色譜柱，美國(guó)Amersham Biosciences公司;Finnigan LCQ Deca XP MAX離子阱質(zhì)譜儀，Thermo Electron Corporation;Procise 491HT氨基酸測(cè)序儀，Applied Biosystems公司。

雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):閩實(shí)動(dòng)質(zhì)準(zhǔn)第002-04號(hào)。

2 方法與結(jié)果

2.1 柱色譜純化

2.1.1 離子交換色譜 采用線性梯度洗脫法，在Poros? CM 4.6/100預(yù)裝柱上純化MP成分。上樣液(A 液)為 pH 4.6，0.02 mol/L 醋酸銨緩沖液;洗脫液(B液)為含0.8 mol/L氯化鈉的A液。測(cè)定A280，繪制洗脫曲線，見圖1。收集主峰組分，濃縮脫鹽。采用SDS-PAGE(Tris-甘氨酸系統(tǒng))堿性不連續(xù)電泳，銀染法鑒定蛇毒蛋白組分的純度。

電泳(濃縮膠為5%，分離膠為15%)結(jié)果表明，經(jīng)Poros? CM 4.6/100預(yù)裝柱純化的MP組分呈單一蛋白條帶，達(dá)到純化目的，見圖2。

圖1 MP組分的Poros? CM 4.6/100離子交換色譜圖Fig.1 Ion-exchange chromatography of fraction MP on Poros?CM 4.6/100 perfusion chromatography column

圖2 眼鏡蛇粗毒及其各色譜分離的活性組分的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of the crude venom and the active fractions on each chromatography

2.1.2 反相色譜 采用 SOURCE? 5RPC ST 4.6/100反相色譜柱，以線性梯度洗脫法純化蛇毒MP成分。上樣液(A液)為 1 mol/L醋酸銨溶液(pH 7.0)-乙腈-水(1∶2∶97);洗脫液(B 液)為 70% 乙腈溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。洗脫色譜顯示單一對(duì)稱主峰(圖3)，收集主峰組分作為質(zhì)譜分析和氨基酸序列測(cè)定的MP樣品。

圖3 MP的SOURCE? 5RPC ST 4.6/100反相色譜圖Fig.3 Elution profile of MP from SOURCE? 5RPC ST 4.6/100 chromatography column

2.2 質(zhì)譜分析

采用Finnigan LCQ Deca XPMAX對(duì)MP進(jìn)行質(zhì)譜分析，測(cè)得MP的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為13 260(圖4)。MP的Mr與眼鏡蛇南洋亞種(Naja naja sputatrix)毒液中的 MI(Mr約13.6 kD)［2］接近，而與曼巴 蛇(Dendroaspis angusticeps) 毒 液 中 的 MTs［5］(Mr約7 kD)及眼鏡蛇孟加拉亞種(Naja kaouthia)MTLPs［6］(Mr約 7 kD)相差較大(表 1)。

圖4 MP的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of MP

2.3 N端氨基酸序列測(cè)定

根據(jù)Edman降解法，采用Procise 491HT測(cè)定MP組分的 N端 16位氨基酸序列，結(jié)果為NLYQFKNMIQCTVPSR (Asn-Leu-Tyr-Gln-Phe-Lys-Asn-Met-Ile-Gln-Cys-Thr-Val-Pro-Ser-Arg)。MP的 N端16位氨基酸序列與MI幾乎一致，并與其他眼鏡蛇毒磷脂酶 A2的序列基本一致［2］，而與 MTs［5］和MTLPs［6］完全不同，提示MP與 MI及其他眼鏡蛇毒磷脂酶A2具有較大的同源性，而與MTs和MTLPs關(guān)系不大(表1)。

2.4 磷脂酶A2活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)［8］，以卵磷脂為底物測(cè)定MP組分的磷脂酶A2活性。在攪拌下，對(duì)照管依次加入底物緩沖液(3.75 mmol/L 卵磷脂、0.1 mol/L 甘氨酸、3.57 mmol/L硼酸、6.03 mmol/L去氧膽酸鈉，調(diào) pH至8.50)8.0 mL、150 mmol/L EDTA 溶液 0.1 mL、受試品0.4mL;測(cè)定管依次加入底物緩沖液8.0 mL、0.5 mol/L氯化鈣溶液0.2 mL、受試品0.4 mL。兩管均于37℃ 水浴60 min，之后對(duì)照管加入0.5 mol/L氯化鈣溶液0.2 mL;測(cè)定管加入150 mmol/L EDTA溶液0.1 mL結(jié)束反應(yīng)。用5 mmol/L鹽酸滴定液將對(duì)照管的pH值滴定至測(cè)定管的pH值，以所消耗的鹽酸計(jì)算測(cè)定管中酶的活力(37℃下，將每分鐘每毫克樣本反應(yīng)消耗鹽酸1μmol定義為一個(gè)磷脂酶A2活性單位)。

經(jīng)測(cè)定，純化MP組分的磷脂酶A2活性為242 U/mg，相當(dāng)于原蛇毒的2.3倍。

表1 MP以及眼鏡蛇磷脂酶A2的N端部分氨基酸序列Tab.1 N-terminal amino acid Sequences of Naja atra muscarinic protein and phospholipase A2 from genus Naja

2.5 小鼠急性毒性試驗(yàn)

取禁食不禁水12 h的小鼠56只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成7組，腹腔注射不同濃度的蛇毒蛋白組分(0.1 mL/10 g體重)。設(shè)計(jì)各組動(dòng)物給予的MP組分劑量為8，10，12.4，15.5，19.3，24 和 30 mg/kg 體重。根據(jù)72 h內(nèi)動(dòng)物的死亡情況，采用Bliss法計(jì)算 LD50值為 14.3 mg/kg。

3 討論

從MP的Mr、N端氨基酸序列以及其磷脂酶A2活性看，認(rèn)為MP是一種類似MI生物活性的蛇毒磷脂酶 A2。

自從1988年 Adem 等［9］首次從 D.angusticeps蛇毒中分離得到兩種能與M膽堿受體高度親和毒素(MT1和MT2)以來，人們陸續(xù)在其它蛇種的蛇毒中發(fā)現(xiàn)了類似的蛇毒成分［1］。根據(jù)這些蛇毒成分的理化性質(zhì)，大致可分為兩類:一類是以D.angusticeps蛇毒中發(fā)現(xiàn)的MTs為代表的蛇毒蛋白［7］。同類的蛇毒成分還有從N.koauthia蛇毒中分離的MTLPs(muscarinic toxin-like proteins)［6］。這類蛇毒蛋白的空間結(jié)構(gòu)與蛇毒突觸后神經(jīng)毒素的所謂“三指蛋白”［10］(具有三個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域，酷似三個(gè)手指而得名)結(jié)構(gòu)相似，幾乎具有相同的氨基酸數(shù)目(63～66個(gè)氨基酸)，Mr約為7 000。另一類是Miyoshi和Tu分別從 N.naja sputatrix 蛇毒分離的 MIs［2-3］，與前一類不同的是，這類蛇毒蛋白具有磷脂酶A2的活性。

根據(jù)理化性質(zhì)分析，本研究從舟山眼鏡蛇蛇毒中分離的MP可歸入上述第二類蛇毒蛋白。首先，從Mr看，MP為13.3 kD 非常接近 N.naja sputatrix蛇毒中的 MI［2］(13.6 kD)，明顯大于 MTs［5］( ～ 7 kD)和 MTLPs［6］( ～7 kD);其次，MP 的 N 端氨基酸序列與眼鏡蛇科蛇毒磷脂酶A2的N端氨基酸序列高度同源，這一點(diǎn)與 MI極其相似;再次，與 MIs［2］相同的是MP也具有磷脂酶A2的酶活性，而MTs和MTLPs均不具有此酶活性。

膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控許多重要生理功能，在生物體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。蛇毒中有很多成分都能影響該系統(tǒng)功能，如突觸后神經(jīng)毒素可抑制運(yùn)動(dòng)終板N型膽堿受體而產(chǎn)生神經(jīng)毒作用，很早就被用于N膽堿受體的研究［11-12］。而蛇毒成分對(duì)M膽堿受體的作用研究只在近年才興起［9］。曼巴蛇毒中的MTs能與M膽堿受體高度親和，某些MTs能激動(dòng)外周和中樞組織的M膽堿受體引起相應(yīng)的效應(yīng)［7］，產(chǎn)生類似M1膽堿受體激動(dòng)劑MCN-A-343和CPCP(4-［N(4-chlorophenyl)carbamoyloxy］-4-pent-2-ynyl-trimethyl-ammonium iodide)的作用，注入大鼠腦內(nèi)海馬部位可顯著改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙［13］。本研究的 MP 成分［4］與 Naja naja sputatrix 蛇毒的 MIs［2］對(duì)大鼠大腦組織M膽堿受體同樣具有高度親和力，且親和力遠(yuǎn)強(qiáng)于MTs［5］，但它們?cè)诶砘再|(zhì)上與MTs有著明顯差別。目前MIs對(duì)M膽堿受體的藥理作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，而本研究已在離體標(biāo)本上觀察到MP激動(dòng)豚鼠回腸M膽堿受體的作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究［4］。

［1］Jerusalinsky D，Kornisiuk E，Alfaro P，et al.Muscarinic toxins:novel pharmacological tools for the muscarinic cholinergic system［J］.Toxicon，2000，38(6):747-761.

［2］Miyoshi S，Tu T A.Phospholipase A2from Naja naja sputatrix venom is a muscarinic acetylcholine receptor inhibitor［J］.Arch Biochem Biophys，1996，328(1):17-25.

［3］Miyoshi S，Tu TA.A snake venominhibitor tomuscarinic acetylcholine receptor)mAChR):isolation and interaction with cloned human mAChR［J］.Arch Biochem Biophys，2000，377(2):290-295.

［4］鄭佳冰，黃立峰，許 盈，等.舟山眼鏡蛇毒蕈堿樣多肽的分離及其對(duì)M膽堿受體的激動(dòng)效應(yīng)［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41(1):1-4.

［5］Jolkkonen M，Van Giersbergen L P，Hellman U，et al.Muscarinic toxins from the black mamba Dendroaspis polylepis［J］.Eur J Biochem，1995，234(2):579-585.

［6］Kukhtina V V，Weise C，Muranova A T，et al.Muscarinic toxin-like proteins from cobra venom［J］.Eur J Biochem，2000，267(23):6784-6789.

［7］Bradley K N.Muscarinic toxins from the green mamba［J］.Pharmacol Ther，2000，85(2):87-109.

［8］陳思鋒，吳中立.體液和組織磷脂酶A2簡(jiǎn)便快速測(cè)定法［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，10(3):254-256.

［9］Adem A，Asblom A，Johansson G，et al.Toxins from the venom of the green mamba Dendroaspis angusticeps that inhibit the binding of quinuclidinyl benzilate to muscarinic acetylcholine receptors［J］.Biochim Biophys Acta，1988，968(3):340-345.

［10］ Fruchart G C，Mourier G，Marquer C，et al.How three-finger-fold toxins interact with various cholinergic receptors［J］.JMol Neurosci，2006，30(1-2):7-8.

［11］ Tu T A.Neurotoxins from snake venom［J］.Chimia，1998(52):56-62.

［12］黃立峰，許云祿.福建產(chǎn)眼鏡王蛇毒神經(jīng)毒素的分離及活性測(cè)定［J］.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38(2):125-128.

［13］ Jerusalinsky D，Kornisiuk E，Bernabeu R，et al.Muscarinic toxins from the venom of Dendroaspis snakes with agonist-like actions［J］.Toxicon，1995，33(4):389-397.

Biochemical characterization of the muscarinic peptide isolated from Naja atra venom

HUANG Li-feng1，YU Chang-xi2
(1.Department of Pharmacy，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Command，F(xiàn)uzhou 350025，China;2.School of Pharmacy，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China)

Purpose To identify the property of the fraction of muscarinic peptide(MP)isolated from Naja atra venom by purifying and determining the biochemical charaterization.Methods MPwas purified by column chromatography.Its molecular weight was determined by mass spectrometry.The partial amino acid sequence of MP was gained by Edman degradation analysis.Lecithin as substrate was used to measure phospholipase A2activity of MP.Bliss method was used to determine the acute toxicity of MPin mice.Results The molecular weight of MP was 13 260 D and its N-terminal 16 amino acid sequence was NLYQFKNMIQCTVPSR，which is consistent with the known venom phospholipase A2.MPalso displayed a strong phospholipase A2activity.The LD50value was 14.3 mg/kg in mice by intraperitoneal injection of MP.Conclusion It is suggested that MP is a snake venom phospholipase A2.

cobra venom;muscarinic peptide;phospholipase A2;biochemical characterization

R284;R285.5;R282.74

A

1005-1678(2012)06-0725-03

2012-04-28

福建省青年科技人才創(chuàng)新項(xiàng)目資助(2008F3084)

黃立峰，男，博士，主管藥師，Tel:0591-22859783，E-mail:huanglifeng@yeah.net。