不同來源鹿茸肽對成骨細胞作用的比較

劉中天，劉吉華，洪 勇，姜 寧，高向東，尚 靖

(中國藥科大學 1.新藥篩選中心，2.生命科學與技術(shù)學院，3.中藥學院，江蘇 南京 210009)

不同來源鹿茸肽對成骨細胞作用的比較

劉中天1，劉吉華3，洪 勇2，姜 寧2，高向東2，尚 靖1

(中國藥科大學 1.新藥篩選中心，2.生命科學與技術(shù)學院，3.中藥學院，江蘇 南京 210009)

目的 比較塔里木馬鹿茸肽與梅花鹿茸肽對成骨細胞增殖分化的影響，并分析藥材差異性。方法 以相同工藝從兩種鹿茸中提取不同肽段的鹿茸肽。以MTT法及PNPP法檢測不同肽段鹿茸肽對原代大鼠成骨細胞的增殖分化作用。采用粉末鑒別及薄層色譜法分析塔里木馬鹿茸與梅花鹿茸的結(jié)構(gòu)及甘氨酸含量差異。以凝膠電泳法及HPLC法分析鹿茸肽成分差異。結(jié)果 從塔里木馬鹿茸中分離得到3種不同肽段的鹿茸肽，分別為相對分子質(zhì)量(Mr)＞30 kD組分(樣A)、Mr5～10 kD組分(樣B)、Mr＞5 kD組分(樣C);從梅花鹿茸中分離得到3種不同肽段的鹿茸肽，分別為Mr＞30 kD組分(樣D)、Mr5～10 kD組分(樣E)、總肽組分(樣F)。樣B和C顯著促進大鼠成骨細胞增殖并上調(diào)堿性磷酸酶活性，樣F僅具有促進細胞增殖作用，其余組分作用微弱。塔里木馬鹿茸與梅花鹿茸粉末形態(tài)類似，但含有更多甘氨酸成分，其鹿茸肽含更多潛在活性成分。結(jié)論 塔里木馬鹿茸與梅花鹿茸存在較大差異，前者包含抗骨質(zhì)疏松成分。

塔里木馬鹿;梅花鹿;鹿茸肽;成骨細胞;增殖;堿性磷酸酶

鹿茸為鹿科動物馬鹿(Cervus elaphus Linnaeus)和梅花鹿(Cervus nippon Temminck)未骨化或稍骨化的幼角，具有益精血、強筋骨、壯腎陽等功效［1］，長期被列為同一藥材入藥。新疆塔里木馬鹿(Cervus elaphus yarkandensis)為我國重要的馬鹿亞種，主要分布于塔里木盆地各沿河地帶［2］，但塔里木馬鹿茸的藥用價值鮮有報道。

本研究擬用相同工藝提取分離不同肽段的塔里木馬鹿茸肽與梅花鹿茸肽，并對其生物活性及成分差異做初步研究，通過與梅花鹿茸肽比較，來探討塔里木馬鹿茸的藥用價值。

1 材料

塔里木馬鹿茸及梅花鹿茸由新疆華士丹藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)中國藥科大學劉吉華教授鑒定為鹿茸。

α-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清，美國invitrogen公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、茜素紅、Ⅱ型膠原酶、維生素C、β甘油磷酸二鈉鹽、TritonX-100，美國Sigma公司;Sephadex G-75蛋白標準品(3.0～70 kD)，中國科學院上海生化研究所;BCA蛋白定量試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸酶(ALP)顯色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所;ALP檢測試劑盒，日本W(wǎng)ako公司。

倒置顯微鏡，日本Olympus公司;Powerpac universal型電泳儀、ChemiDoc XRS凝膠成像儀，美國Bio-rad公司;LC-2010 HT高效液相色譜儀、LcSolution1.11sp1工作站，日本Shimadzu公司;Safire2型微孔板測讀儀，瑞士TECAN公司。

2 方法

2.1 鹿茸肽的制備

分別將塔里木馬鹿茸干品與梅花鹿茸干品鋸成小段，浸入乙醇-水(2∶1)，4 ℃，浸泡 7 d，取出切片，37℃烘干，干茸片打成粉末，稱重，按每1 g加入5 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 3.5)20 mL，冰浴攪拌浸提12 h;4℃，12 000 r/min離心20 min，得上清;－0.1 mPa，0.45 μm 水系混合濾膜濾過，濾出液為鹿茸干品總多肽粗提液，經(jīng)乙醇沉淀除雜蛋白，每1 000 mL 分別經(jīng)30000 MWCO、10000 MWCO、5000 MWCO切向超濾膜包截留濃縮至約50 mL，分別得鹿茸多肽組分相對分子質(zhì)量(Mr＞30 kD、Mr＞10 kD、Mr＞5 kD。所得鹿茸多肽組分Mr＞10 kD經(jīng)5000 MWCO(PES)切向超濾膜包截留濃縮，得鹿茸多肽組分Mr5～10 kD。經(jīng)冷凍干燥，得馬鹿茸多肽組分 Mr＞30 kD(樣 A)、Mr5 ～10 kD(樣 B)、Mr＞5 kD(樣C)，梅花鹿茸多肽組分Mr＞30 kD(樣 D)、Mr5 ～10 kD(樣 E)及梅花鹿茸總肽(樣 F)［3-4］。

2.2 鹿茸肽對成骨細胞作用

2.2.1 原代成骨細胞培養(yǎng) 采用酶消化法培養(yǎng)大鼠成骨細胞，取新生SD大鼠(雌雄不限)，取出顱骨，清理骨膜、血管等結(jié)締組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗顱骨3遍至白色，并剪成1 mm×1 mm的骨片。加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃消化20 min，以清除纖維組織;加入0.1%Ⅱ型膠原酶溶液于37℃振蕩消化60 min。細胞消化液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，于1 000 r/min離心10 min，沉淀細胞用α-MEM+10%FBS制成懸液，重復(fù)上述Ⅱ型膠原酶消化步驟。將2次消化獲得的細胞混勻，并接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，待細胞生長至80%融合，用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)溶液消化傳代培養(yǎng)。取生長良好的第3代細胞用于實驗及細胞功能鑒定［5］。

2.2.2 成骨細胞增殖測定 將第3代成骨細胞以1×105細胞/孔，接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后更換低血清 α-MEM，分別加入 0.1，1.0，10.0 μg/mL樣品A～F，每組重復(fù)5孔。給藥1，3，7 d，每孔加入0.5 mg/mL MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(DMSO)150μL，振蕩10 min，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值。

2.2.3 ALP活力測定 將第3代成骨細胞，以1×106細胞/孔，接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后更換低血清 α-MEM，分別加入 0.1，1.0，10.0 μg/mL 樣品A～F，每組重復(fù)5孔。給藥3和7 d后，TritonX-100提取蛋白，并用BCA法定量檢測蛋白。依據(jù)ALP檢測試劑盒說明，在96孔板中加入蛋白上清液20 μL與PNPP(對硝基苯磷酸二鈉)溶液100μL。于37℃下孵育15 min，中止反應(yīng)，用酶標儀在405 nm波長處測定吸光度值。

2.3 鹿茸粉末形態(tài)比較

分別取塔里木馬鹿鹿茸與梅花鹿鹿茸粉末少許，醋酸甘油裝片，鏡下觀察其表皮角質(zhì)層、毛茸及骨碎片形態(tài)。

2.4 鹿茸薄層色譜比較

分別取塔里木馬鹿茸粉末與梅花鹿茸粉末0.4 g，加 70%乙醇 5 mL，超聲處理 15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取甘氨酸對照品，加70%乙醇制成2 mg/mL對照品溶液。吸取供試品溶液各8 μL、對照品溶液1μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%茚三酮丙酮溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

2.5 Tricine-SDS-PAGE 電泳

分別制備并灌注分離膠(凝膠濃度為16.5%)、間隙膠(凝膠濃度為10%)和濃縮膠(凝膠濃度為4%)。上樣鹿茸肽樣品20μg，采用恒定電壓電泳方法，濃縮膠及夾層膠電泳:電壓60 V，電流15 mA;分離膠電泳:電壓120 V，電流25 mA，至電泳結(jié)束。將凝膠置于固定液(0.5%戊二醛，30%乙醇)固定20 min;置于染色液(50%甲醇，10%乙醇，0.2%G-250)染色30 min;置于脫色液(45%甲醇，10%冰醋酸)脫色30 min，并將膠放入水中。當電泳條帶清晰，脫色完成［6］。

表1 鹿茸肽促成骨細胞增殖作用(n=5s)Tab.1 Effects of velvet peptides on osteoblast proliferation(n=5s)

表1 鹿茸肽促成骨細胞增殖作用(n=5s)Tab.1 Effects of velvet peptides on osteoblast proliferation(n=5s)

與對照組比較:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01，3 P ＜0.0011 P ＜0.05，2 P ＜0.01，3 P ＜0.001 vs control group

?

2.6 HPLC 分析

2.6.1 色譜條件 DIKMA Diamonsil-C18分析柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);C18預(yù)柱;柱溫:40 ℃，流速:0.6 mL/min;進樣量:20 μL;檢測波長:280 nm;流動相:乙腈-0.1%三氟乙酸溶液(40∶60)。

2.6.2 供試品溶液制備 精密稱取鹿茸肽樣品各100μg，分別置于5 mL量瓶內(nèi)，各加20 mmol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH 4.5)，搖勻，濾過，得供試品溶液。

2.7 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 鹿茸肽對成骨細胞作用比較

3.1.1 鹿茸肽對成骨細胞增殖作用影響 結(jié)果見表1。與對照組相比，給予鹿茸肽1 d，馬鹿茸肽(樣A、B、C)及梅花鹿茸肽(樣D和E)均對成骨細胞無明顯增殖作用，但中劑量梅花鹿鹿茸總肽(樣F)表現(xiàn)出明顯增殖作用(P＜0.05)。給予鹿茸肽3 d，中低劑量馬鹿鹿茸肽樣C顯著促進成骨細胞增殖(P＜0.01);梅花鹿鹿茸肽組中，低劑量樣D、中高劑量樣F顯著促進成骨細胞增殖(P＜0.01)。給予鹿茸多肽7 d，中高劑量馬鹿茸肽樣B、低劑量馬鹿鹿茸肽樣C及中劑量梅花鹿茸樣F表現(xiàn)出顯著促成骨細胞增殖作用(P＜0.05或0.01)。結(jié)果表明，塔里木馬鹿茸肽(Mr5～10 kD、Mr＞5 kD)及梅花鹿鹿茸總肽具有顯著促成骨細胞增殖作用;與梅花鹿茸肽(Mr5～10 kD)相比，相同組分的塔里木馬鹿茸肽顯著促進成骨細胞增殖。

3.1.2 鹿茸肽對成骨細胞ALP活性影響 結(jié)果見表2。給予鹿茸肽3 d，馬鹿茸肽及梅花鹿茸肽均對ALP活性無明顯上調(diào)作用。與對照組相比，多數(shù)鹿茸肽對ALP活性起到一定抑制作用。給予鹿茸肽7 d，成骨細胞ALP活性上調(diào)。與對照組相比，梅花鹿鹿茸肽對ALP活性無顯著上調(diào)作用;而中低劑量的馬鹿茸肽能顯著上調(diào)ALP活性，其中低劑量樣B和C對ALP活性升高作用尤為明顯(P＜0.01或0.001)。結(jié)果表明，與梅花鹿茸肽(Mr5～10 kD)相比，相同組分塔里木馬鹿茸肽顯著促進成骨細胞分化。

表2 鹿茸肽對成骨細胞ALP活性的影響(n=5s)Tab.2 Effects of velvet peptides on ALPactivity of primary osteoblast(n=5s)

表2 鹿茸肽對成骨細胞ALP活性的影響(n=5s)Tab.2 Effects of velvet peptides on ALPactivity of primary osteoblast(n=5s)

與對照組比較:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01，3 P ＜0.0011 P ＜0.05，2 P ＜0.01，3 P ＜0.001 vs control group

?

3.2 鹿茸粉末形態(tài)及甘氨酸含量比較

3.2.1 鹿茸粉末形態(tài)比較 塔里木馬鹿茸粉末淡棕黃色，鏡下觀察可見表皮角質(zhì)層淡棕色或棕黃色，可見多角形紋格，表面顆粒深棕色;茸毛脫落后的毛窩呈圓洞狀。毛茸較多較粗，碎斷，毛茸中部直徑22～85μm，表面由扁平細胞(鱗片)呈復(fù)瓦狀排列的毛小皮包圍，細胞的游離緣指向毛尖，皮質(zhì)有棕色色素;髓質(zhì)斷續(xù)或無。骨碎片表面有縱紋及點狀孔隙;骨陷窩呈類圓形或類梭形，邊緣骨小管呈放射狀溝紋(圖2A)。梅花鹿鹿茸粉末形態(tài)與塔里木馬鹿茸粉末形態(tài)類似(圖2B)，兩者無明顯區(qū)別。

圖2 塔里木馬鹿茸(A)和梅花鹿茸鹿茸(B)粉末結(jié)構(gòu)鑒定Fig.2 Microscopic identification of Cervus elaphus yarkandensis antler powder(A)and Cervus nippon Temminck antler powder(B)

3.2.2 鹿茸甘氨酸含量比較 由薄層色譜圖(圖3)可知，與甘氨酸對照品相比，鹿茸醇提液的色譜顏色均較淡。與梅花鹿茸色譜相對應(yīng)位置上，塔里木馬鹿茸顯相同棕色主副斑點，且顏色較深。斑點顏色深淺表明，塔里木馬鹿茸較梅花鹿茸含有更多甘氨酸成分。

圖3 鹿茸薄層色譜鑒別Fig.3 Thin layer chromatography assay of antlers

3.3 鹿茸肽成分比較

3.3.1 鹿茸肽電泳條帶比較 鹿茸肽Mr5～10 kD組分的活性差異提示，塔里木馬鹿茸肽與梅花鹿茸肽可能存在成分差異。將鹿茸肽Mr5～10 kD組分進行Trincine-SDS-PAGE檢測，可清晰觀察到馬鹿茸肽(樣B)與梅花鹿茸肽(樣E)均集中于Mr6～7 kD，電泳條帶清晰可見(圖4)。結(jié)果表明，塔里木馬鹿茸肽活性組分(Mr5～10 kD)與梅花鹿茸肽組分(Mr5～10 kD)條帶無顯著差異。

3.3.2 鹿茸肽HPLC分析比較 由HPLC色譜圖(圖5)可知，5～10 kD塔里木馬鹿茸肽及梅花鹿茸肽含有共有吸收峰 a、b、c、d、e、f，其保留時間分別為3.8，5.2，8.2，10.8，11.8 和 16.0 min。與梅花鹿茸肽Mr5～10 kD相比，馬鹿茸肽Mr5～10 kD含有特征吸收峰 g、h、i，其保留時間分別為 5.9，6.7 和18.7 min(圖5A)。結(jié)果表明，塔里木馬鹿茸肽含有異于梅花鹿茸肽的成分，這可能是其促進成骨細胞增殖分化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖4 塔里木馬鹿茸肽(A)和梅花鹿茸肽(B)Trincine-SDSPAGE電泳Fig.4 Trincine-SDS-PAGE assay of velvet peptides of Cervus elaphus yarkandensis(A)and Cervus nippon Temminck(B)

圖5 塔里木馬鹿茸肽(A)和梅花鹿茸肽(B)M r 5-10 kD組分HPLC圖Fig.5 HPLC chromatograms of M r 5-10 kD velvet peptides of Cervus elaphus yarkandensis(A)and Cervus nippon Temminck(B)

4 討論

鹿茸為我國名貴補益中藥，可應(yīng)用于畏寒乏力、陽痿滑精、腰脊酸軟、小兒骨軟行遲及免疫力低下等癥的治療［7-8］。中國藥典將馬鹿與梅花鹿歸為同一藥材，臨床上也鮮見其療效對比的報道。本研究通過塔里木馬鹿茸與梅花鹿茸對比，表明不同來源鹿茸肽對成骨細胞活性作用存在差異，這與相關(guān)報道結(jié)果類似［9］。將同屬不同種鹿茸列為同一藥材是不嚴謹?shù)模⒂械K鹿茸相關(guān)制劑的開發(fā)。

ALP是成骨細胞的特異性酶，大量表達的ALP顯示成骨細胞向成熟成骨細胞分化能力上升［10］。在成骨細胞生長中早期，塔里木馬鹿茸肽抑制ALP表達;在成骨細胞生長中晚期，塔里木馬鹿肽(Mr5～10 kD、Mr＞5 kD)卻顯著促進細胞ALP表達。這表明塔里木馬鹿茸肽可能同時含有成骨分化激動劑和抑制劑，成骨分化抑制劑在細胞生長中早期發(fā)揮主要效應(yīng)，而激動劑在細胞生長中晚期起主要作用，顯著上調(diào)ALP活性。梅花鹿茸肽抑制ALP表達，可能是由于梅花鹿茸經(jīng)干燥后，活性成分被一定程度破壞［11］，而抑制成分并未遭完全破壞。研究表明，塔里木馬鹿茸不同于梅花鹿茸，前者含有防治骨質(zhì)疏松的潛在成分。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:303.

［2］馬合木提·哈力克.新疆塔里木馬鹿(Cervus elaphus yarkandensis)研究進展及展望［J］.新疆大學學報:自然科學版，2009，26(3):262-270.

［3］Guan SW，Duan L X，Li Y Y，et al.A novel polypeptide from Cervus nippon Temminck proliferation of epidermal cells and NIH3T3 cell line［J］.Acta Biochim Pol，2006，53(2):395-397.

［4］王 豐，梅子青，周秋麗，等.鹿茸多肽的分離純化及藥理活性［J］.吉林大學學報，2003，41(1):111-114.

［5］王洪復(fù).骨細胞圖譜與骨細胞體外培養(yǎng)技術(shù)［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，2001:54.

［6］孫 波，遲玉杰，徐 寧，等.Tricine-SDS-PAGE電泳檢測蛋清肽分子量的研究［J］.食品科學，2008，29(5):385-388.

［7］謝 敏，朱至明，歐蘭芳.鹿茸粉的制備與臨床療效觀察［J］.河南中醫(yī)學院學報，2006，21(4):70.

［8］吉靜嫻，錢 璟，黃鳳杰，等.鹿茸的活性物質(zhì)及藥理作用的研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2009，30(2):141-143..

［9］周秋麗，劉永強，王 穎，等.梅花鹿茸和馬鹿茸多肽化學性質(zhì)及生物活性比較［J］.中國中藥雜志，2001，26(10):699-702.

［10］ Lian J B，Stein G S.Development of the osteoblast phenotype:molecular mechanisms mediating osteoblast growth and differentiation［J］.Iowa Orthop J，1995，15(3):118-140.

［11］田再民，武玉環(huán)，龔學臣，等.加熱對鮮鹿茸中堿性磷酸酶活性的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(5):1874-1875.

Comparison of the effects of velvet peptides isolated from different antlers on osteoblast activation

LIU Zhong-tian1，LIU Ji-hua3，HONG Yong2，JIANG Ning2，GAO Xiang-dong2，SHANG Jing1
(1.New Drug Screening Center，2.Shool of Life and Technology，3.School of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Purpose To compare the effects of velvet peptides isolated from antlers of Tarim red deer(Cervus elaphus Yarkandensis)and sika deer(Cervus nippon Temminck)on osteoblast proliferation and differentiation，and to analyze the difference between the two antlers.Methods The velvet peptides were isolated from the above mentioned antlers by same technique.Effects of velvet peptides on osteoblast proliferation and Alkaline phosphatase(ALP)activity were determinated through MTT and PNPP assay.Microscopic method was adopted to identify the structures of the two antlers.Glycine content of antlers was tested by thin layer chromatography assay.The constituents of velvet peptides were identified by Trincine-SDS-PAGE and HPLC，respectively.Results Three different peptides，Mr＞30 kD(A)，Mr5-10 kD(B)and Mr＞5 kD(C)，were isolated from the antler of Tarim red deer.Meanwhile，other three peptides，Mr＞30 kD(D)，Mr5-10 kD(E)and total peptides(F)，were extracted from the antler of sika deer.Sample B and Cincreased osteoblast proliferation and ALPactivity significantly，while sample Fcould only stimulate cell proliferation.Antlers of Tarim red deer contain more glycine inside than those of sika deer，though their structures were similar.More potential functional constituents were found in the ve lvet peptides isol-ated from Tarim red deer.Conclusion The Tarim red deer and sika deer are different from each other.The velvet peptides from Tarim red deer may function as antiosteoporotic agents.

Tarim red deer(Cervus elaphus Yarkandensis);sika deer(Cervus nippon Temminck);velvet peptides;primary osteoblast;proliferation;alkaline phosphatase

R284.2;R285.5;R282.74

A

1005-1678(2012)06-0701-05

2012-04-12

新疆維吾爾白治區(qū)科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項目(201153116);烏魯木齊高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科技創(chuàng)新基金項目(CX09209W)

劉中天，男，碩士研究生，E-mail:wojiushilzt@yahoo.com.cn;尚 靖，女，通信作者，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:天然藥物活性研究;高向東，女，通信作者，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:生物新藥研制，E-mail:xdgao@cpu.edu.cn。