不同溫度、鹽度下滸苔（Entromorphra prolifera）群體增長和生殖的顯微觀測＊

張曉紅，王宗靈，李瑞香＊，李 艷，王 曉

（1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；2.海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程國家海洋局重點實驗室，山東 青島266061）

不同溫度、鹽度下滸苔（Entromorphra prolifera）群體增長和生殖的顯微觀測＊

張曉紅1，2，王宗靈1，2，李瑞香1，2＊，李 艷1，2，王 曉1，2

（1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；2.海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程國家海洋局重點實驗室，山東 青島266061）

為研究溫度、鹽度對滸苔（Entromorphraprolifera）群體增長和生殖的影響，在實驗室內(nèi)設10個溫度梯度、每個溫度下又設4個鹽度梯度，比較了不同培養(yǎng)條件下藻體的濕重、特定生長率（SGR）。滸苔生長對溫度的變化較鹽度的變化為敏感。在同一鹽度下，滸苔SGR隨溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。隨著鹽度的降低，最適生長溫度有升高的趨勢。20℃、S為26時滸苔SGR最高，達37.80%。SGR高的實驗組最先進入生殖生長期，隨之，SGR驟降，藻體形態(tài)也發(fā)生的變化。通過對這一變化過程的觀測研究加深對綠潮暴發(fā)及演化過程的理解。

滸苔；特定生長率；營養(yǎng)生長；生殖生長

（高 峻 編輯）

自2007年以來，我國黃海連續(xù)暴發(fā)大規(guī)模的滸苔（Entromorphraprolifera）綠潮，其規(guī)模、覆蓋范圍、持續(xù)時間和對環(huán)境的影響程度屬世界罕見。尤其是2008年，青島近岸海域在2008－06中旬涌現(xiàn)大規(guī)模滸苔綠潮，2008－06底最大影響面積達25 000km2，僅青島市就打撈滸苔近80萬t，造成直接經(jīng)濟損失13.22億元；2009年黃海海域最大分布面積達58 000km2，此后幾年黃海滸苔綠潮的影響面積都在20 000km2以上，對沿岸地區(qū)造成不同程度的經(jīng)濟損失［1］。滸苔生長到底有多快？其適宜的環(huán)境因子有哪些？能否根據(jù)其生長速率來預測綠潮發(fā)展態(tài)勢？滸苔對溫度、鹽度的適宜性如何？這些都是我們的重要研究內(nèi)容。

有研究表明，滸苔生長的最適宜的t為15～25℃，S為20.2～26.9［2］。孢子釋放的最適宜的t為20～35℃，S為28～40，均相對較高［3］。也有學者對孢子的早期分裂和葉狀體的形成進行了顯微觀察［4］。滸苔的大量增殖與其多種生殖方式有關，主要包括有性生殖和無性生殖及營養(yǎng)生殖［5］。王曉坤等［6］、林阿朋和沈頌東［5］觀察到以藻段再生、原生質體（細胞）再生所代表的營養(yǎng)繁殖普遍存在于滸苔的各種生活史中。國外學者Hiraoka等［7］發(fā)現(xiàn)滸苔存在3種生活史（1種有性生活史和2種無性生活史），并闡述了3種生活史的交替。通過定量觀測發(fā)現(xiàn)，扁滸苔（E.compressa）的大部分生殖細胞均能在短時間內(nèi)附著，但也會有一些不能附著［8］。通過野外取樣和室內(nèi)培養(yǎng)的方法，證明冬季水體中孢子的存儲量決定了第2年滸苔的新生個體量［9］。研究鹽度、營養(yǎng)鹽和光照對滸苔屬孢子早期生長影響時發(fā)現(xiàn)，鹽度對其影響最大，高鹽度有促進作用，低鹽度抑制其生長［10］。

漂流聚集的滸苔通常是以營養(yǎng)繁殖的方式不斷進行藻體擴增［11］，而大量生殖細胞的釋放又向海區(qū)內(nèi)輸入了更多的新個體。溫度、鹽度對滸苔的這2個關鍵階段及其之間過渡均有較大影響。通過藻體培養(yǎng)和同步顯微觀測實驗，探討了不同溫度、鹽度對滸苔群體增長和生殖過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

滸苔藻體于2009－04采自江蘇南通如東近海紫菜養(yǎng)殖區(qū)筏架，采集后用消毒海水沖洗，低溫充氣暫養(yǎng)帶回實驗室。馬上選取健康、較完整的藻體用于實驗。在15℃，光強100μmol·m－2·s－1馴化3d后進行試驗。實驗用海水取自山東青島沙子口附近海域，沉淀過濾，高溫消毒后使用。培養(yǎng)液為PES［6］。

1.2 培養(yǎng)條件

GXZ3－250D型培養(yǎng)箱，光強100～110μmol·m－2·s－1，光暗比12L∶12D。

10個溫度梯度，分別為5℃，8℃，11℃，14℃，17℃，20℃，23℃，26℃，29℃，32℃。每個溫度又設4個鹽度梯度14，20，26，32。共40個溫鹽組合，每個組合設3個平行樣。

500mL PES培養(yǎng)液內(nèi)加入（0.50±0.01）g馴化后的藻體。培養(yǎng)過程中每天定時用玻璃棒攪拌水體3～5次，6d更換一次培養(yǎng)液。實驗共進行15d。

1.3 稱重方式

3d取樣稱重一次。撈出培養(yǎng)液中的藻體，抽干表面水分。抽濾裝置由布氏漏斗（漏斗內(nèi)鋪有直徑9cm的定性濾紙）、抽濾瓶和真空泵組成，泵壓在0.02MPa左右。每個樣品抽濾1min（預實驗證明，此壓力下抽濾對藻體無明顯影響，抽濾1min后藻體重量基本穩(wěn)定），用Mettler Toledo Pl203型10－3g電子天平稱量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

計算特定生長率（SGR）［12］：

式中，W0為藻的初始濕重（g）；Wt為試驗結束時藻的濕重（g）；t為試驗持續(xù)的天數(shù)。其中第1～6天的SGR用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行雙因子方差分析以及Duncan多重比較，分析不同溫度、鹽度下滸苔SGR的差異顯著性（P＜0.05）。

1.5 顯微觀察

取樣稱重時，撈出藻體，將培養(yǎng)水體混勻后取5mL水樣，Lugol’s溶液固定［13］。使用Nikon ECLIPSE TE2000－U顯微鏡，觀察并拍照記錄水體中和藻體細胞的變化。

2 結 果

2.1 不同溫度、鹽度下15d內(nèi)滸苔濕重及特定生長率的變化

2.1.1 藻體濕重隨時間變化

S為14，15d時，32℃下的濕重最大，達5.40g，5℃溫度組濕重最低，為2.46g（圖1）。S為20，20℃組濕重始終最高，15d后增至5.95g，較初始量增加了近11倍；5℃組的濕重最低，15d時的濕重僅為2.68 g（圖2）。S為26，20℃組的濕重明顯高于其他溫度組的，15d后濕重達6.02g。然而32℃濕重和14℃的相當，相對較低。S為32下，20℃組各時間點的濕重均最高，15d后濕重高達6.13g，其次23℃，29℃，17℃三個溫度組的濕重較高，26℃，32℃組濕重較低，其中濕重最低的溫度組是5℃（圖4）。

各溫度、鹽度組合下滸苔濕重隨培養(yǎng)時間呈不斷增長的趨勢，在實驗結束時各溫度、鹽度梯度組的濕重較初始值都有極大的升高。從圖1～4可以較明顯地看出S為20～32，最適的生長溫度在20℃；在S為14時，滸苔最適生長的溫度較高，為29℃。隨著鹽度的降低，最適生長溫度有升高的趨勢。

同一溫度不同鹽度條件下的比較發(fā)現(xiàn)，t為32℃，S為14組的濕重最高（5.41g），S為20組次之（5.15 g），S為26組最低。t為14～29℃時各實驗組均在S為32時終濕重最高，其中最高濕重為6.13g（20℃，S為32組）。5～11℃各實驗組在S為14～20范圍內(nèi)最終濕重較高（4.00g左右）?；境尸F(xiàn)極高溫、極低溫環(huán)境下低鹽度較利于滸苔生長，而在14～29℃時高鹽度較利于其生長。

2.1.2 特定生長率隨時間變化

4個鹽度組的SGR變化趨勢基本相同。在此僅列舉了S為26的不同溫度組15d內(nèi)特定生長率（SGR）的變化（圖5）。第1～3天的SGR，除5℃外，其余溫度組均在25%以上。在第3～6天除14℃和17℃兩組外，其余溫度組的SGR均降至20%以下。第6～9天較低溫組的5℃、8℃的SGR較高，分別為20.20%和15.75%，而其他溫度組均在10%左右。第9～12天5℃、8℃的SGR有所下降，分別為13.59%和12.41%，其他溫度組的SGR均在10%以下。第12～15天各組的SGR均在10%以下，但5℃、8℃的SGR仍相對較高（8.45%左右），32℃組的SGR已降至1.25%。

因為4個鹽度組的SGR變化趨勢基本相同，故分為14～32℃溫度組和5～11℃溫度組討論。14～32℃組在第1～3天時SGR最高，第1～3天時SGR驟降，第6～15天SGR均較低且變化趨勢較緩；5～11℃組的SGR呈先降低后升高再降低的趨勢。第1～6天14～32℃溫度組的SGR明顯高于5～11℃組，第6～15天后者SGR高于前者的。

圖5 S為26時下不同溫度梯度藻體的特定生長率隨培養(yǎng)時間的變化Fig.5 Changes of specific growth rate（SGR）for E.proliferaat different temperatures and 26salinity during culture time

2.2 不同溫度、鹽度下特定生長率（SGR）比較

對藻體及培養(yǎng)水體的顯微觀測表明，約培養(yǎng)第6天前后藻體陸續(xù)進入生殖生長階段，很多實驗組SGR驟降。在比較溫度、鹽度對生長率的影響時，為避免生殖生長的影響，僅對前6天的SGR數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan多重比較。

2.2.1 滸苔生長受溫度、鹽度影響的方差分析結果

方差分析結果表明，溫度、鹽度單因子對滸苔的生長都有極顯著影響（P＜0.01）。從均方值來看，滸苔生長對溫度的變化更為敏感。溫度和鹽度對滸苔生長存在顯著交互效應（P＜0.05）（表1）。

表1 溫度、鹽度對滸苔SGR影響的可重復兩因素方差分析統(tǒng)計結果Table 1 The statistic results of repeatable two－factors variance analysis on the effects of temperature and salinity on the growth rate of E.prolifera

2.2.2 不同溫度對滸苔生長影響的比較

在5～20℃，SGR范圍是14%～35%，并存在顯著差異（P＜0.05），生長率隨溫度增加而明顯升高。在t為20～26℃，SGR達到最高（34%左右），且溫度間無顯著差異。但隨溫度繼續(xù)上升至29℃，32℃時，滸苔生長率卻出現(xiàn)了下降趨勢。綜上所述，滸苔生長率隨溫度的增加呈先升高后降低的趨勢，20～26℃最適宜滸苔生長。

2.2.3 不同鹽度對滸苔生長的影響

鹽度對滸苔藻體生長的影響較大，隨著鹽度的升高生長率也在增加，其中S為26生比率最高，32時較高。S為14組SGR明顯低于S為20組，低鹽度組（14和20）生長率顯著低于高鹽組（26和32）（P＜0.05）。

2.2.4 溫度和鹽度的交互效應

圖6 各溫度、鹽度條件下藻體第1～6天的SGR（%）Fig.6 Specific growth rate（SGR）of E.prolifera at different temperatures and salinities（%）

在同一鹽度下，生長率隨溫度的增加先升高后降低。S為20～32時，滸苔最大增長率出現(xiàn)在20℃；S為14時滸苔在23～26℃時增長率最大。比較鹽度對滸苔SGR的影響時發(fā)現(xiàn)，5～11，29和32℃時鹽度對滸苔SGR的影響并不明顯，14～26℃時鹽度的影響相對明顯。

第1～6天，t＞20℃與所有鹽度組合下的SGR均在30% 以上，其中t為20～23℃，S為26～32時滸苔SGR均高于36%；20℃、S為26實驗組SGR最高，達37.80%（如圖6）。

2.3 對藻體及其繁殖體的觀測

在實驗過程中，也對藻體和繁殖體進行了顯微觀測。由于本實驗溫度梯度較多，將分3組進行討論：5～11℃，14～23℃和26～32℃。

不同溫度下，藻體形態(tài)隨時間變化的趨勢大致相同。早期藻體均以營養(yǎng)生長為主，主枝變粗（部分呈囊泡狀或片狀），分枝增殖明顯（圖7b）。之后，藻段（或藻體）顏色由綠色變?yōu)榈S色（圖7c），進入了生殖生長階段。在此期間，顯微鏡下觀察有孢子（配子）囊出現(xiàn)（圖7d）。1d后的顯微觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)水中有較多游動的生殖細胞出現(xiàn)（圖7e）。幾天后觀察到，在培養(yǎng)水體和培養(yǎng)器皿壁上均出現(xiàn)生殖細胞固著后萌發(fā)成的幼體（圖7h）。

生殖生長出現(xiàn)的時間，26～32℃組出現(xiàn)的最早，5～11℃組出現(xiàn)的最晚。觀測的詳細情況見表2。

培養(yǎng)液中共存著滸苔的多種繁殖體，如各種類型的生殖細胞、不同時期的萌發(fā)幼體、斷裂后繼續(xù)營養(yǎng)生長的小藻段等，各種形態(tài)、數(shù)量巨大的繁殖體構成了滸苔的“繁殖體庫”。

實驗觀察表明，相對于溫度而言，鹽度對生殖生長的影響并不明顯。

圖7 滸苔藻體的形態(tài)Fig.7 Morphological changes of E.prolfera

表2 各溫度條件下的藻體形態(tài)變化及顯微觀察結果Table 2 Morphological changes and microscopic observation of different temperature groups

3 討 論

3.1 藻體生長率變化與生殖生長

整個培養(yǎng)期內(nèi)，滸苔藻體一進入生殖生長階段，生長率會出現(xiàn)顯著下降，5℃組，8℃組在9～15d生長率明顯高于26～32℃，主要原因可能是低溫組前期生長緩慢，后期仍有較多藻體處于營養(yǎng)生長期從而保持了較高生長率。

培養(yǎng)前期，26～32℃組滸苔藻體生長率較高，同時也較早地進入生殖生長階段，而其藻體形態(tài)的表現(xiàn)是主枝由管狀變?yōu)槠瑺?。曾有學者報道，片狀葉狀體的孢子釋放能力要明顯強于絲狀或管狀葉狀體［3］。這與本文的結果相吻合。

3.2 滸苔最適生長的溫度、鹽度條件

20℃、S為26實驗組的SGR最高，達37.80%。本實驗中滸苔最適生長條件是t為20～26℃，S為26～32，此期間增長率能達到36%以上。與王建偉等［3］實驗得出滸苔生長的最適宜的t為20～25℃、S為24～28相近。

在同一實驗鹽度下，滸苔SGR均隨溫度的增加呈先升高后降低的趨勢。5～11℃和29～32℃均不利于滸苔的生長。高鹽度下（S為20～32），滸苔在20℃時增長率最大，低鹽度下（S為14）滸苔在23～26℃時增長率最大，低鹽度下最大生長率出現(xiàn)的溫度有升高的趨勢。

3.3 藻體形態(tài)及顏色的變化

在藻體頂端的細胞容易形成生殖細胞囊［4］。但本研究中，生殖細胞囊也可能開始形成于藻體中部。成熟的葉狀體形成生殖細胞囊，反映在藻段顏色變化上，是由深綠變成淡黃色，顏色變化范圍由某個藻段擴展到整個藻體。形成孢子（配子）囊的藻段可在幾分鐘內(nèi)釋放大量的生殖細胞（如顯微鏡高光強條件下），釋放后的細胞形成空殼。藻體形態(tài)和顏色的變化可以作為藻體生長階段的標識。

3.4 滸苔繁殖體的顯微觀察

培養(yǎng)后期，對培養(yǎng)液顯微觀察發(fā)現(xiàn)，有大量的萌發(fā)幼體在水體中懸浮或漂浮生長。此現(xiàn)象說明生殖細胞可以固著于水體中微小的懸浮物上萌發(fā)生長。還有的生殖細胞固著在原藻體上萌發(fā)生長。燒杯底部出現(xiàn)大量的萌發(fā)幼體，主要是由于生殖細胞在重力作用下下沉后固著，萌發(fā)［8］。

培養(yǎng)液中、器皿壁上固著的生殖細胞以及其他各種繁殖體可以近似的看做是滸苔的“繁殖體庫”［14］。但由于生殖細胞的釋放，藻段的分解，致使微生物和原生動物大量繁殖。滸苔繁殖體庫會因原生動物等的攝食而遭受損失。不良環(huán)境下其繁殖體能存活數(shù)月，等環(huán)境適宜它們就會萌發(fā)生長［15］。繁殖體庫對于海藻的生命史至關重要，對滸苔繁殖體庫的研究還有待于進一步探討。

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Microscopic Observation on Population Growth and Reproduction ofEntromorphraproliferaUnder Different Temperature and Salinity

ZHANG Xiao－h(huán)ong1，2，WANG Zong－ling1，2，LI Ri－xiang1，2，LI Yan1，2，WANG Xiao1，2
（1.TheFirstInstituteofOceanography，SOA，Qingdao 266061，China；2.KeyLabofScienceand EngineeringforMarineEcologicalEnvironment，SOA，Qingdao 266061，China）

In order to study the effects of temperature and salinity on the growth and reproduction ofEntromorphraprolifera，ten temperature levels（5～32℃）and four salinity levels（14～32）under each temperature level were set，and the algae wet weight and specific growth rate（SGR）under different culture conditions were studied.The growth of the algae was sensitive to the changes of temperature，other than to that of salinity.At the same salinity，the SGR had a trend of increase followed with a decrease.With the decrease of the salinity，the increase of the temperature was suitable for growth.E.proliferahad a highest SGR of 37.80%at 20℃and salinity of 26.Those groups with high SGR entered reproductive phase first and followed with a sharp decrease of SGR and morphological changes of the algae.This observation will help us deeply understand the green algae bloom and evolvement process.

Entromorphraprolifera；specific growth rate；regetative growth；reproductive growth

October 11，2010

A

1671－6647（2012）02－0276－08

2010－10－11

國家重點基礎研究發(fā)展計劃——我國近海藻華災害演變機制與生態(tài)安全（2010CB428703）；國家科技支撐項目——滸苔綠潮藻暴發(fā)應急處置關鍵技術研究與應用（2008BAC49130），青島近海滸苔綠潮形成的生物學與生態(tài)學機制（2008T30）

張曉紅（1986－），女，山東臨沂人，碩士研究生，主要從事綠潮生態(tài)學方面研究.E－mail：zxh0828a＠163.com

＊通訊作者，E－mail：liruixiang＠fio.org.cn