印尼熱泉中產(chǎn)嗜熱堿性蛋白酶菌株篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究＊

王 帥，林學(xué)政，黃曉航，鄭 立，ZILDA Dewi Seswita

（1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266061；2.印度尼西亞海洋與漁業(yè)研究局 海洋生物技術(shù)與水產(chǎn)品加工研究中心，雅加達(dá)999006）

印尼熱泉中產(chǎn)嗜熱堿性蛋白酶菌株篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究＊

王 帥1，林學(xué)政1，黃曉航1，鄭 立1，ZILDA Dewi Seswita2

（1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266061；2.印度尼西亞海洋與漁業(yè)研究局 海洋生物技術(shù)與水產(chǎn)品加工研究中心，雅加達(dá)999006）

采用MSM寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基從印度尼西亞Pantai cermin，Kalianda和Banyuwedang三個(gè)地區(qū)的熱泉水樣、泥樣以及沉積物樣品中分離獲得細(xì)菌菌株，通過(guò)檢測(cè)蛋白酶產(chǎn)生透明圈和福林酚蛋白酶活性測(cè)定相結(jié)合的方法，從中篩選出1株產(chǎn)嗜熱蛋白酶的菌株P(guān)BI，該菌株經(jīng)初步鑒定為短桿菌屬（Brevibacillus），并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，菌株P(guān)BI產(chǎn)蛋白酶的最適酶活溫度為60℃，最適pH值為8.0～9.0，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，60℃時(shí)酶的半衰期為30min，70℃條件下20min仍保持46.1%的酶活，該酶在pH值為5.0～9.0范圍的緩沖液中酶活相對(duì)穩(wěn)定。其產(chǎn)嗜熱蛋白酶的酶活力最高可達(dá)到60.53U/mL，在100℃條件下仍能保留26.37%的相對(duì)酶活。Fe2＋，F(xiàn)e3＋，Cu2＋和Zn2＋對(duì)嗜熱蛋白酶活性具有明顯的抑制作用。該嗜熱蛋白酶對(duì)EDTA敏感，苯甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑酶肽（Leupeptin）、芐瞇（Benzamidine）和胃蛋白酶抑制劑（Pepstain A）對(duì)該嗜熱蛋白酶都有一定的抑制作用，說(shuō)明其酶活性受到絲氨酸、半胱氨酸殘基的影響。結(jié)果表明，該菌株是1株具有進(jìn)一步改造利用價(jià)值的產(chǎn)蛋白酶菌株。

熱泉；嗜熱細(xì)菌；嗜熱蛋白酶；鑒定

（王佳實(shí) 編輯）

近年來(lái)，嗜熱菌已成為人們?nèi)找嬷匾暡⒗玫奈⑸镔Y源，其合成的多種耐熱酶系具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。自1879年米奎爾（P.Miquel）從法國(guó)塞納河中分離到能在70℃條件下生長(zhǎng)的桿菌以來(lái)，人們就在各種各樣的高溫環(huán)境——尤其是熱泉中，開(kāi)展了嗜熱菌的研究工作［1－3］。一般認(rèn)為在55℃以上的環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物稱為嗜熱菌，包括處于系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)底部的部分細(xì)菌和古菌，其中最適生長(zhǎng)溫度在80℃以上的稱為極端嗜熱菌，其大部分是嗜熱古菌［4］。嗜熱酶是從嗜熱微生物中分離得到的一類熱穩(wěn)定性酶，這種酶蛋白的重要特征就是只有在極高溫度下才不可逆變性失去催化活性，從而提高了底物和產(chǎn)物的溶解性，加快催化反應(yīng)速率，殘留生物固形物濃度很低，同時(shí)還可以降低染菌的可能性。嗜熱蛋白酶由于其顯著的耐熱性及其對(duì)有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑等具有較強(qiáng)的抗性，所以，可有效地應(yīng)用于需高溫條件的工業(yè)生產(chǎn)中，取代傳統(tǒng)的常溫酶催化或化學(xué)催化方法，為在食品加工、醫(yī)藥制品、廢水處理、皮革加工、造紙等諸多方面優(yōu)化工藝流程開(kāi)辟出新的途徑，因此已成為酶學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一［5－6］。這樣看來(lái)，對(duì)于嗜熱蛋白酶的研究就顯得更為必要和迫切。

蛋白酶是一種主要作用于蛋白質(zhì)和多肽，催化肽鍵水解的酶，在工業(yè)生產(chǎn)中具有非常重要的作用。微生物是蛋白酶重要的來(lái)源之一，微生物來(lái)源的蛋白酶一般屬于胞外酶，較動(dòng)植物來(lái)源的蛋白酶易于分離純化。許多嗜熱菌（細(xì)菌、真菌、古菌和放線菌等）均可以產(chǎn)生胞外嗜熱蛋白酶，人們從脂肪嗜熱芽孢桿菌［7－8］（Bacillusstearothermophilus），短小芽孢桿菌［9］（Bacilluspumilus），枯草芽孢桿菌［10］（Bacillussubtilis），莫哈韋芽孢桿菌［11］（Bacillusmojavensis），芽孢桿菌［12］（Bacillussp.JB－99），F(xiàn)ervidobacteriumpennivorans［13］，掘越氏火球菌［14］（Pyrococcushorikoshii），嗜熱芽孢桿菌［6］（Thermophilicbacillus），水生嗜熱菌［15］（Thermosaquaticus），Thermoplasmaacidphilum［16］，嗜熱棲熱菌［17］（Thermusthermophilus）和熱厭氧桿菌［18］（Thermoanaerobacteryonseiensis）等嗜熱菌中分離得到各種類型的嗜熱蛋白酶。如Huang等［6］對(duì)嗜熱枯草桿菌HS08（Thermophilicbacillusstrain HS08）中性嗜熱蛋白酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，所得蛋白酶在40～65℃間均具有較好的熱穩(wěn)定性，于65℃下反應(yīng)1h后仍可保留75%的酶活力；從掘越氏熱球菌（PyrococcushorikoshiiOT3）中分離到最佳活性溫度為90℃，最適pH為8.0的1種Zn2＋依賴性金屬蛋白酶，兼有羧肽酶和氨基酰化酶的雙功能蛋白酶［14］；張燕新等［19］報(bào)道，從云南溫泉分離到3株產(chǎn)蛋白酶的嗜熱菌SB11、SB31和SC5，屬于土芽孢桿菌屬（Geobacillus），其蛋白酶活力分別為35.6，26.1和26.6U/mL，最適生長(zhǎng)溫度為60℃，最適pH為6.0，其中菌株SB31的蛋白酶最適酶反應(yīng)溫度高達(dá)80℃，遠(yuǎn)高于一般動(dòng)植物來(lái)源的蛋白酶。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于嗜熱菌的研究開(kāi)展的工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，對(duì)于印度尼西亞熱泉地區(qū)的嗜熱菌資源的研究至今還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究室從印度尼西亞3個(gè)地區(qū)的熱泉地區(qū)樣品中篩選嗜熱菌菌株并進(jìn)行分離純化，在獲得可培養(yǎng)嗜熱菌菌株的基礎(chǔ)上，通過(guò)MSM寡營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)基平板法復(fù)篩，獲得1株產(chǎn)嗜熱蛋白酶菌株P(guān)BI，研究發(fā)現(xiàn)PBI于55℃下培養(yǎng)72h，其產(chǎn)蛋白酶的酶活力最高可達(dá)60.53U/mL，同時(shí)對(duì)微生物的多樣性和嗜熱蛋白酶的分類和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為今后嗜熱菌及其酶的開(kāi)發(fā)利用積累資源。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品為印度尼西亞Pantai cermin，Kalianda和Banyuwedang三個(gè)地區(qū)的熱泉水樣、泥樣以及沉積物樣品，將采集的水樣、泥樣、沉積物樣品裝入無(wú)菌容器中，充氮后于4℃下保存。3個(gè)地區(qū)熱泉的地點(diǎn)和水溫分別為：5°37′59″N，105°04′20″E，95～97℃；5°41′50″N，105°36′15″E，62～65 ℃；8°10′38″N，114°35′26″E，44.8～46℃左右。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

MSM 培養(yǎng)基（Minimal Synthetic Medium）：0.1%K2HPO4；0.01%MgSO4·7H2O；0.1%NaCl；0.7% （NH4）2SO4；0.05%酵母粉；1.5%瓊脂，1%脫脂奶粉。

1.2.2 菌體的獲得和純化

采集的水樣取100μL直接涂布平板，泥樣用滅菌海水浸泡、靜置后取100μL涂布平板，55℃培養(yǎng)2～3d，觀察菌落形態(tài)。菌體通過(guò)平板劃線法進(jìn)行分離和純化，獲得具有透明圈的菌株。為了得到純菌落，分離純化步驟至少進(jìn)行3次，通過(guò)革蘭氏染色、鏡檢及16SrDNA基因測(cè)序鑒定獲得純培養(yǎng)菌株，編號(hào)后接入斜面保存。

1.2.3 細(xì)菌16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化

提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒采用酵母基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Yeast DNA Kit），由北京天根生物技術(shù)有限公司提供。菌株P(guān)BI的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析中DNA模板的制備、16SrDNA的PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析均按照林學(xué)政等［20］進(jìn)行。

1.2.4 粗酶液制備

將菌株P(guān)BI種子液按1%的接種量接種于含50mL MSM培養(yǎng)基的150mL錐形瓶中，在55℃，150r/min的培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)72h后，取12 000g離心15min后取上清，即為粗酶液。

1.2.5 嗜熱蛋白酶活性檢測(cè)

采用紫外分光光度－Folin酚法測(cè)定蛋白酶粗酶液的酶活。酶活力單位的定義：在40℃，pH值為7.5的條件下，每分鐘催化酪蛋白水解產(chǎn)生1μg酪氨酸所需液體酶的酶量為1個(gè)活力單位（U/mL）。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 蛋白酶的溫度耐受性以及熱穩(wěn)定性

取500μl酶液置于2mL離心管中，將500μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的酪蛋白溶液作為底物，加入1mL 0.4 mol/L的三氯乙酸（TCA）終止酶反應(yīng)，并用Folin酚法測(cè)定蛋白酶粗酶液的酶活。將酶液在不同的溫度下（40，50，60，70，80，90，100 ℃）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別保溫10，20，30，40，50，60，120，180min后，加入過(guò)量0.4mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，12 000g離心15min，測(cè)定酶活，以最大酶活性作為相對(duì)酶活性100%，以剩余的酶活性作為評(píng)價(jià)酶熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。

1.2.6.2 蛋白酶的pH耐受性以及pH穩(wěn)定性

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的酪蛋白溶液作為底物，用Folin酚法測(cè)定蛋白酶粗酶液的酶活。不同的pH緩沖體系：Na2HPO4－檸檬酸，pH 5.0～7.0；Tris－HCl，pH 7.0～9.0；Glycine－NaOH，pH 9.0～12.0。將500μL酶液與不同pH緩沖液調(diào)整pH后的酪蛋白溶液反應(yīng)，分別于10，20，40，60，80min后測(cè)定酶活，以最大酶活性作為相對(duì)酶活性100%，以剩余的酶活性作為評(píng)價(jià)酶pH穩(wěn)定性的指標(biāo)。

1.2.6.3 金屬離子和蛋白酶抑制劑對(duì)酶活性的影響

在蛋白酶與底物的反應(yīng)體系中，加入不同的金屬離子（Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋，F(xiàn)e2＋，F(xiàn)e3＋，Cu2＋，Zn2＋，Ba2＋，Sr2＋），使其終濃度分別為5mmol/L和10mmol/L；加入蛋白酶抑制劑（EDTA，苯甲基磺酰氟PMSF，亮抑酶肽Leupeptin，胃蛋白酶抑制劑Pepstain A和芐瞇Benzamidine）終濃度分別為0.5mmol/L和1 mmol/L，以不加任何金屬離子和蛋白酶抑制劑的酶活為100%，檢測(cè)其剩余酶活。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離純化

將印度尼西亞Pantai cermin、Kalianda和Banyu wedang 3個(gè)地區(qū)的熱泉水樣、泥樣以及沉積物樣品在MSM培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)、分離和純化后獲得的菌株，用牙簽點(diǎn)到篩選平板上，在55℃條件下靜置培養(yǎng)1～2d，菌株P(guān)BI能在MSM寡營(yíng)養(yǎng)鹽培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生清晰可見(jiàn)的透明圈，透明圈直徑和菌落直徑的比值為6.4。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

革蘭氏染色呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，此菌平板培養(yǎng)菌落近圓形，邊緣整齊，不透明，表面光滑無(wú)褶皺。顯微鏡鏡檢菌株為短桿狀，大小為（1～2）×（4～7）μm。

2.2.1 菌株鑒定

將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，菌株P(guān)BI所測(cè)得的16SrDNA序列與短桿菌屬Brevibacillusborstelensisstrain Mq－17（GU201855）的16SrDNA序列同源性為1375/1375（100%）。因此，鑒定該菌株為短桿菌屬菌株（Brevibacillus），命名為PBI，此菌株的16SrDNA序列已上傳到GenBank上，序列號(hào)為HQ166187。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響

由圖1可見(jiàn)，菌株P(guān)BI在MSM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)液上清液中開(kāi)始檢測(cè)到少量嗜熱蛋白酶活力，進(jìn)入到穩(wěn)定期后酶活力迅速上升，至48h后產(chǎn)酶量趨于穩(wěn)定，嗜熱短桿菌PBI蛋白酶產(chǎn)量與菌株生長(zhǎng)具有正相關(guān)關(guān)系（24～60h）。產(chǎn)嗜熱蛋白酶的酶活力最高達(dá)到60.53U/mL。

圖1 時(shí)間對(duì)菌株P(guān)BI酶活的影響Fig.1 Effects of time on enzyme activity of strain PBI

2.4 溫度和pH值對(duì)酶活力的影響

以酪蛋白為底物，在不同溫度（40～100℃，pH7.5）和不同pH 值（pH5.0～12.0，55℃）條件下測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖2～3，由圖可見(jiàn)，該嗜熱蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH值為8.0～9.0。

2.5 酶的熱穩(wěn)定性

將酶樣品分別置于不同溫度保溫，按一定時(shí)間間隔取樣測(cè)定酶活力。由圖4可見(jiàn)，該嗜熱蛋白酶在一定溫度范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好，在60℃保溫10min后酶活力下降幅度很小，隨著溫度升高，酶的熱穩(wěn)定性下降，60℃時(shí)酶的半衰期為30min，70℃條件下20 min仍保持46.1%的酶活。

圖4 酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Effects of temperature on enzyme stablity

圖5 酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 Effects of pH on enzyme stablity

2.6 pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

將適量酶液與不同pH值緩沖液混合調(diào)整pH值，取500μL于60℃條件下保溫一定時(shí)間后，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力。由圖5可見(jiàn)，在60℃條件下，該酶在pH值為5.0～9.0范圍的緩沖液中相對(duì)酶活差別不大，說(shuō)明在這個(gè)pH值范圍酶活相對(duì)穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸下降，至80min時(shí)最大酶活已降低到不足20%。在強(qiáng)堿性（pH 值分別為10.0，11.0，12.0）條件下分別保溫20，40，60，80min后，相對(duì)酶活有明顯降低，并且隨著pH值的增大，下降的幅度也越來(lái)越大。

2.7 金屬離子對(duì)酶活性的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋，F(xiàn)e2＋，F(xiàn)e3＋，Cu2＋，Zn2＋，Ba2＋和Sr2＋等金屬離子對(duì)PBI菌株產(chǎn)嗜熱蛋白酶活性的影響，在酶液中分別加入5mmol/L和10mmol/L不同種類的金屬離子溶液，依標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定蛋白酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出，低濃度Fe2＋（5mmol/L）對(duì)酶的活性幾乎沒(méi)有影響，但隨著濃度的增加，F(xiàn)e2＋的濃度為10mmol/L時(shí)，酶的相對(duì)活性僅剩余10%左右。Fe3＋，Cu2＋和Zn2＋對(duì)嗜熱蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)3種金屬離子濃度為5mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活性分別僅剩余64.23%，51.20%和46.15%，當(dāng)離子濃度達(dá)到10mmol/L時(shí)幾乎可使蛋白酶活性完全被抑制，其余幾種金屬離子也存在著一定的抑制作用。

表1 金屬離子對(duì)嗜熱蛋白酶活性的影響Table 1 Effect of metal ion on thermophilic protease activity

2.8 酶抑制劑對(duì)酶活性的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了蛋白酶抑制劑（EDTA、苯甲基磺酰氟PMSF、亮抑酶肽Leupeptin、胃蛋白酶抑制劑Pepstain A和芐瞇Benzamidine）等對(duì)PBI菌株所產(chǎn)嗜熱蛋白酶活性的影響，在酶液中分別加入0.5mmol/L和1.0mmol/L不同種類的蛋白酶抑制劑，依標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定蛋白酶活力。由表2可見(jiàn)，該嗜熱蛋白酶對(duì)EDTA敏感，該酶可能是金屬離子蛋白酶。苯甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑酶肽（Leupeptin）和芐瞇（Benzamidine）對(duì)該嗜熱蛋白酶都有一定程度的影響。

表2 蛋白酶抑制劑對(duì)嗜熱蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of protease inhibitor on thermophilic protease activity

3 討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，為了使培養(yǎng)的細(xì)菌具有多樣性，我們盡量使培養(yǎng)條件接近于其自然環(huán)境，除保證溫度、濕度外，用其生境的水樣經(jīng)高溫消毒后配制培養(yǎng)基，從而保證菌體正常生長(zhǎng)，同時(shí)采用MSM培養(yǎng)基進(jìn)行菌株篩選，與LB、2216E培養(yǎng)基相比，降低了其中營(yíng)養(yǎng)成分濃度以協(xié)調(diào)因成分過(guò)于充足導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)菌株占據(jù)更多的生態(tài)位，應(yīng)用這一方法我們分離到69株嗜熱菌，并從中篩選得到6株產(chǎn)嗜熱蛋白酶的菌株。

高溫微生物具有獨(dú)特的基因類型、特殊的生理機(jī)制及特殊的代謝產(chǎn)物，具有很高的研究?jī)r(jià)值。有關(guān)嗜熱蛋白酶產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究已有不少，但研究結(jié)果有所差異。Qasim和Rani［11］對(duì)摩加夫芽孢桿菌（Bacillusmojavensis）進(jìn)行研究，其產(chǎn)生的堿性嗜熱蛋白酶具有較強(qiáng)抗氧化性，最適溫度和最適pH值分別為60℃和10.5，在pH值為7.0～11.5的范圍內(nèi)持續(xù)48h仍具有良好的穩(wěn)定性，當(dāng)溫度在60℃，65℃和70℃條件下，半衰期分別為150，15和7min，不受金屬離子的影響。Adinarayana等［21］從BacillussubtilisPE－11分離得到絲氨酸屬耐高溫堿性蛋白酶，最適溫度為60℃，最適pH值為10.0，添加10mmol/L濃度的Ca2＋有助于提高其溫度穩(wěn)定性。陳啟和等［22］從芽孢桿菌屬（Bacillussp.EL3）菌株中分離得到1種彈性蛋白酶，最適作用溫度和pH值分別為50℃和7.4，該酶在40℃以下保溫30min酶活仍較高，在60℃以上酶活全部喪失。在pH值為7.4～9.0的范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，而在pH7.0以下時(shí)，酶活下降很快。Cu2＋、Zn2＋、Al3＋能抑制蛋白酶的活性，而Fe3＋、Li2＋能激活彈性蛋白酶活性，螯合劑EDTA則嚴(yán)重抑制蛋白酶活性。本研究從印度尼西亞熱泉樣品中分離到1株嗜熱蛋白酶產(chǎn)生菌PBI，經(jīng)培養(yǎng)特征觀察和16SrDNA序列分析鑒定，該菌株鑒定為短桿菌屬（Brevibacillus），并對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，菌株P(guān)BI的最適酶活溫度為60℃，最適pH值為8.0～9.0，具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，其產(chǎn)嗜熱蛋白酶的酶活力最高可達(dá)60.53U/mL，60℃和70℃時(shí)酶的半衰期分別為30min和10min，在100℃條件下仍能保留26.37%的相對(duì)酶活。低濃度Fe2＋能增強(qiáng)嗜熱蛋白酶的活性，而Fe3＋，Cu2＋和Zn2＋對(duì)嗜熱蛋白酶活性具有明顯的抑制作用，Ca2＋的添加未增強(qiáng)酶活性。EDTA可明顯抑制酶活性，這說(shuō)明該酶可能是羧肽酶A/B，而且EDTA是金屬離子螯合劑，可螯合酶蛋白的輔基金屬離子，因此該蛋白酶酶活性可能受金屬離子影響。苯甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑酶肽（Leupeptin）和芐瞇（Benzamidine）對(duì)該嗜熱蛋白酶都有一定程度的影響，這可能是抑制劑與酶活性中心以外的絲氨酸、半胱氨酸殘基作用而引起酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變而影響了酶活力，但2種氨基酸殘基應(yīng)該沒(méi)有處于該酶的活性中心。胃蛋白酶抑制劑（Pepstain A）使嗜熱蛋白酶的活性降低則說(shuō)明該蛋白酶有一部分是酸性蛋白酶，并且對(duì)酶活具有一定抑制作用。

目前，新分離獲得的嗜熱和極端嗜熱微生物的數(shù)量正在不斷增加，所發(fā)現(xiàn)的相關(guān)嗜熱酶證明在該領(lǐng)域具有巨大潛力［23－24］。嗜熱蛋白酶能抵抗堿性及陽(yáng)離子或非離子表面活性劑，可用于廚房洗滌劑，熱穩(wěn)定的蛋白酶極易耐受這種堿性條件及60℃的溫度。在嗜熱酶催化的反應(yīng)條件下（超過(guò)70℃），對(duì)反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低，減少了能耗，生產(chǎn)中不需要冷卻裝置，節(jié)省了開(kāi)支，降低了冷卻過(guò)程中對(duì)環(huán)境所造成的污染，同時(shí)因反應(yīng)中很少有雜菌生存，可以大大減少各種代謝物對(duì)產(chǎn)物的污染［25］。

（References）：

［1］RUAN L W，LIU X，YANG H J，et al.Isolation and identification of thermophilic microorganisms［J］.Journal of Xiamen University（Natural Sci），2006，45（2）：276－279.阮靈偉，劉欣，楊海杰，等.嗜熱菌分離篩選及分子分類初探［J］.廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，45（2）：276－279.

［2］PENG Y L，HE P Q，HUANG X H，et al.Isolation，identification and study ofHalomonassp.YD－7from deep－sea hydrothermal vent in Indian ocean［J］.Advances in Marine Science，2009，27（3）：367－375.彭亞林，何培青，黃曉航，等.印度洋深海海熱液區(qū)一株鹽單胞菌Halomonassp.YD－7的分離鑒定及研究［J］.海洋科學(xué)進(jìn)展，2009，27（3）：367－375.

［3］LIU Y，HUANG X H，HE P Q，et al.Molecular identification and phylogenetic analysis of cultivable bacteria from Indian ocean hydrothermal vents［J］.Advances in Marine Science，2009，27（2）：193－200.劉艷，黃曉航，何培青，等.印度洋深海熱液區(qū)可培養(yǎng)細(xì)菌的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.海洋科學(xué)進(jìn)展，2009，27（2）：193－200.

［4］HE Z Z，PENG Q，CHEN J Y.The thermophiles biology［M］.Beijing：Science Press，2000，1－234.和致中，彭謙，陳俊英.高溫菌生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2000，1－234.

［5］WU J，BIAN Y，TANG B，et al.Cloning and analysis of WF146protease，a novel thermophilic subtilisin－like protease with four inserted surface loops［J］.FEMS Microbiology Letters，2004，230（2）：251－258.

［6］HUANG G R，YING T J，HUO P，et al.Purification and characterization of a protease fromThermophilicbacillusstrain HS08［J］.African Journal of Biotechnology，2006，5（24）：2433－2438.

［7］SOOKKHEO B，SINCHAIKUL S，PHUTRAKUL S，et al.Purification and characterization of the highly thermostable proteases fromBacillusstearothermophilusTLS33［J］.Protein Expression and Purification，2000，20：142－151.

［8］TANG B，ZHOU L F，CHEN X D，et al.Production and some properities of a thermophilic protease fromBacillusstearothermophilusWF146［J］.Acta Microbiologica Sinica，2000，40（2）：188－192.唐兵，周林峰，陳向東，等.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫蛋白酶的產(chǎn)生條件及酶學(xué)性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2000，40（2）：188－192.

［9］KUMAR C G.Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilicBacilluspumilus［J］.Letters in Applied Microbiology，2002，34（1）：13－17.

［10］ZHANG M，ZHAO C，DU L X，et al.Molecular cloning of a thermostable neutral protease gene fromBacillusstearothermophilusin a vector plasmid and its expression and purification in Bacillus subtilis［J］.Science China C：Life China，2008，38（2）：166－172.張敏，趙叢，杜連祥，等.嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫中性蛋白酶在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)、純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.中國(guó)科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2008，38（2）：166－172.

［11］QASIM K B，RANI G.Purification and characterization of an oxidation－stable，thiol－dependent serine alkaline protease fromBacillus mojavensis［J］.Enzyme and Microbial Technology，2003，32（2）：294－304.

［12］JONAVESLY B，MANJUNALH B R，NAIK G R.Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate for production of a thermostable alkaline proteinase from thermoalkaliophilicBacillussp.JB－99［J］.Bioresource Technology，2002，82（1）：61－64.

［13］KLUSKENS L D，VOORHORST W G，SIEZEN R J，et al.Molecular characterization of fervidolysin，a subtilisin－like serine protease from the thermophilic bacteriumFervidobacteriumpennivorans［J］.Extremephiles，2002，6（3）：185－194.

［14］ISHIKAWA K，ISHIDA H，MATSUI I，et al.Novel Bifunctional Hyperthermostable Carboxypeptidase/Aminoacylase fromPyrococcushorikoshiiOT3［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001：67（2）：673－679.

［15］OLEDZKA G，DABROWSKI S，KUR J.High－level expression，secretion，and purification of the thermostable aqualysin I fromThermusaquaticusYT－1inPichiapastoris［J］.Protein Expression and Purification，2003，29：223－229.

［16］BEADELL J S，CLARK D S.Probing stability－activity relationship in the thermophilic protease fromThermoplasmaacidphilumby randorn mutagenesis［J］.Extremephiles，2001，5（1）：3－10.

［17］YAMAGATA A，MASUI R，KAKUTA Y，et al.Overexpression，purification and characterization of RecJ protein fromThermusthermophilusHB8and its core domain［J］.Nucleic Acids Research，2001，29（22）：4617－4624.

［18］JANG H J，KIM B C，PYUN Y R，et al.A novel subtilisn－like serine protease from Thermoanerobacter yonseiensis KB－1：its cloning，expression，and biochemical properties［J］.Extremophiles，2002，6（3）：233－243.

［19］ZHANG Y X，ZHAO Y，XU J L，et al.Isolation and characterization of three thermophilic proteases－producing bacteria［J］.Chinese Journal of Applied Environmental Biology，2007，13（4）：561－564.張燕新，趙印，許敬亮，等.3株高溫蛋白酶產(chǎn)生菌的分離與鑒定［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13（4）：561－564.

［20］LIN X Z，CHEN K S，HE P Q，et al.The effects ofSuaedasalsaL.planting on the soil microflora in coastal saline soil［J］.Acta Ecologica Sinica，2006，26（3）：801－807.林學(xué)政，陳靠山，何培青，等.種植鹽地堿蓬改良濱海鹽漬土對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（3）：801－807.

［21］ADINARAYANA K，ELLAIAH P，PRASAD D S.Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolatedBacillussubtilisPE－11［J］.AAPS P harmaceutical Science and Technology，2003，4（4）：440－448.

［22］CHEN Q H，HE G Q，WU Y L.Screening of elastase－producing strains and primariry studies on fermentation conditions［J］.Journal of Zhejiang University：Agric.＆Life Sci.，2003，29（1）：59－64.陳啟和，何國(guó)慶，鄔應(yīng)龍.彈性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件的初步研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2003，29（1）：59－64.

［23］GUO C L，WANG T，ZHU W，et al.The 16SrRNA ofThermusthermophiles from two high temperature hot springs of West Yunnan［J］.Journal of Yunnan University，2003，25（5）：458－462.郭春雷，王濤，祝偉，等.滇西二高溫溫泉中Thermus高溫菌的16SrRNA［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，25（5）：458－462.

［24］XUE Y，XU Y，LIU Y，et al.Thermoanaerobactertengcongensissp.nov.，a novel anaerobic，saccharolytic，thermophilic bacterium isolated from a hot spring in Tengcong，China［J］.International Journal of Systematics Evolution Microbiological，2001，51：1335－1341.

［25］WANG D M，BAI F Q.The stability of thermozymes and their application prospect［J］.Journal of Shandong Agricultural University：Natural Science，2006，37（3）：477－478.王冬梅，白復(fù)芹.嗜熱酶的穩(wěn)定性及其應(yīng)用前景［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，37（3）：477－478.

Screening and Characterization of a Crude Thermophilic Alkaline Protease From an Isolated Strain ofBrevibacillusPBI in Indonesia's Hot Spring

WANG Shuai1，LIN Xue－zheng1，HUANG Xiao－h(huán)ang1，ZHENG Li1，ZILDA Dewi Seswita2
（1.TheKeyLaboratoryofMarineBioactiveSubstances，TheFirstInstituteofOceanography，SOA，Qingdao 266061，China；2.ResearchCenterformarineandfisheryproductprocessingandbiotechnology，Jakarta 999006，Indonesia）

Thermophilic bacteria strains were isolated from water samples，soil samples and sediment samples of three Indonesia＇s hot spring area（Pantai cermin，Kalianda and Banyu wedang）by using MSM oligomedium.A strain of bacterium，by detecting hydrolysis halos of protease and its activity.The protease belonged to thermophilic alkaline protease，which showed high－temperature stability and pH stability.In addition，the results revealed that the optimal temperature and pH were 60℃and 8.0～9.0for protease activity，respectively.The enzyme activity decreased faintly at 60℃for 10min，the enzyme stability declined with increasing temperature，the enzyme half－life is 30min at 60 ℃，enzyme activity remained 46.1%at 70℃for 20min，the enzyme activity was relatively stable in the range of pH5.0～9.0.And the highest protease activity was 60.53U/mL.At 100℃，the protease still remained 26.37%relative enzyme activity.The effects of different metal ions（Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋，F(xiàn)e2＋，F(xiàn)e3＋，Cu2＋，Zn2＋，Ba2＋and Sr2＋）and protease inhibitor（EDTA，PMSF，Leupeptin，Pepstain A and Benzamidine）on thermophilic protease activity were investigated.It was found that low concentration of Fe3＋could promote the production of thermophilic protease.In contrast，the protease activity was inhibited markedly by Fe3＋，Cu2＋and Zn2＋.The thermophilic protease was sensitive to EDTA，its activity was decreased with the increased of EDTA concentration.And the protease activity was also inhibited in a certain extent by PMSF，Leupeptin，Benzamidine and Pepstain A，it showed that the enzyme activity declined was due to the effects of serine，cysteine residues.Based on the above results，the strain PBI had shown interesting properties in producing thermophilic protease.

hotspring；thermophilic bacterium；thermophilic protease；identification

March 16，2011

Q93

A

1671－6647（2012）02－0244－08

2011－03－16

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)項(xiàng)目——印尼熱泉生態(tài)系統(tǒng)微生物多樣性及其產(chǎn)嗜熱酶研究（2010G13），海洋專性解烴菌Cycloclasticusspp.的代謝特征及協(xié)同降解高分子量多環(huán)芳烴的研究（2010G23）

王 帥（1983－），女，山東濟(jì)南人，助理研究員，碩士，主要從事極端環(huán)境微生物方面研究.E－mail：wangshuai＠fio.org.cn