柴胡皂甙d干預(yù)肺纖維化VEGF/PEDF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

鄭金旭 許 清 管淑紅 劉繼柱 宋 萍 湯 燕 吳立艷

柴胡皂甙d干預(yù)肺纖維化VEGF/PEDF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究*

鄭金旭 許 清 管淑紅 劉繼柱 宋 萍 湯 燕 吳立艷

目的：觀察柴胡皂甙（SS）d對(duì)博來霉素（BLM）致肺纖維化小鼠的肺組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）/色素上皮衍生因子（PEDF）在不同時(shí)間表達(dá)變化的調(diào)節(jié)作用，并探討其與抗肺纖維化作用的關(guān)系。方法：將80只小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組，BLM組，SSd大、小劑量組。治療組分別每天腹腔注射不同劑量SSd（2.0 mg/kg,1.0 mg/kg），分別于3、7、14及28 d時(shí)觀察纖維化程度，樣本堿水解法檢測(cè)肺組織中羥脯氨酸（HYP）含量，免疫熒光觀察PEDF、VEGF蛋白在肺內(nèi)表達(dá)的規(guī)律，RT-PCR觀察各時(shí)間點(diǎn)PEDF、VEGF mRNA表達(dá)的強(qiáng)度。結(jié)果：BLM組和SSd大、小劑量組均呈纖維化逐漸進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化，28 d時(shí)，SSd大、小劑量組纖維化程度較BLM組輕（P<0.01）；BLM組和SSd大、小劑量組HYP含量隨時(shí)間增加逐漸增加，7、14及28 d時(shí)SSd大、小劑量組HYP含量均低于BLM組（P<0.001）；BLM組及SSd大、小劑量組VEGF表達(dá)從3 d時(shí)開始升高，第7天達(dá)高峰，后呈下降趨勢(shì)，28 d達(dá)低點(diǎn)，PEDF表達(dá)總體呈逐漸增高趨勢(shì)；SSd大、小劑量組VEGF表達(dá)比BLM組降低，PEDF表達(dá)升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：SSd能夠抑制肺纖維化進(jìn)展，機(jī)制可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)，上調(diào)PEDF的表達(dá)有關(guān)。

柴胡皂甙 肺纖維化 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類 博來霉素 羥脯氨酸 RNA,信使 疾病模型,動(dòng)物

肺纖維化是許多間質(zhì)性肺病的共同結(jié)局，病理特征表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究表明，伴隨著肺纖維化的進(jìn)程，肺微血管密度呈現(xiàn)先增多后減少的特征，這種變化與纖維化進(jìn)展息息相關(guān)[1-2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）/色素上皮衍生因子（PEDF）是其中一對(duì)較重要的促/抗血管活性因子，目前對(duì)于VEGF/PEDF的動(dòng)態(tài)變化尚少見報(bào)道。柴胡皂甙（SS）d是從傳統(tǒng)中藥中提取的有效單體成分，具有抗脂質(zhì)過氧化，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β 1表達(dá)，抗血管生成等作用[3-4]。本研究旨在探討SSd對(duì)肺纖維化小鼠VEGF/PEDF的調(diào)節(jié)作用及其抗肺纖維化的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）主要試劑：博來霉素（BLM）購自日本化藥株式會(huì)社；SSd購自江西本草天工科技有限責(zé)任公司；羥脯氨酸（HYP）試劑盒、Masson染色試劑盒購自南京建成生物公司；兔抗小鼠VEGF、PEDF多克隆抗體購自Santa Cruz公司，CY3標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德公司；RT-PCR試劑盒購自南京碧波生物公司。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)6周齡雄性昆明種小鼠80只，體質(zhì)量18~22 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立及分組 將80只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照（Cont）組，博來霉素模型（BLM）組以及SSd大（2.0 mg/kg）、小劑量（1.0 mg/kg）組，每組20只。模型組和SSd大、小劑量組均采用BLM復(fù)制動(dòng)物纖維化模型[5]，氣管內(nèi)一次性按體質(zhì)量5 mg/kg注入BLM溶液0.04 mL（5 g/L），立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)2 min，盡可能讓藥液在肺內(nèi)分布均勻，縫合皮膚，待動(dòng)物自然清醒后放入籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。Cont組按上述造模方法氣管內(nèi)注入等體積生理鹽水。SSd溶液的配置：分別取SSd 20 mg、10 mg，各溶入二甲基亞砜（DMSO）3 mL中，靜置10 min，用生理鹽水稀釋至100 mL，避光保存。造模后，SSd大、小劑量組每天分別腹腔內(nèi)注入0.2 g/L、0.1 g/L SSd溶液0.2 mL，BLM組和Cont組每天腹腔內(nèi)注入0.2 mL生理鹽水+DMSO（3 mL DMSO溶于97 mL生理鹽水），連續(xù)28 d。

1.2.2 標(biāo)本收集 給藥第3、7、14及28天，每組分別隨機(jī)處死5只小鼠，立即取出小鼠肺組織，右肺組織保存于-70℃冰箱，用于檢測(cè)VEGF、PEDF mRNA以及HYP含量測(cè)定；左肺完整肺葉置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于Masson染色以及免疫熒光檢測(cè)。

1.2.3 病理切片觀察 將多聚甲醛溶液固定好的左肺組織石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，做Masson染色，光鏡下觀察肺組織損傷程度及膠原纖維增生程度。纖維化程度評(píng)價(jià)，0級(jí)：正常肺組織，無或僅有少量細(xì)絲狀膠原纖維。Ⅰ級(jí)：膠原纖維輕度增多，呈細(xì)束狀。Ⅱ級(jí)：膠原纖維重度增多，融合成細(xì)帶狀，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。Ⅲ級(jí)：膠原纖維明顯增多，成寬帶狀或片狀，肺泡塌陷融合。肺纖維化等級(jí)資料按0級(jí)計(jì)1分，Ⅰ級(jí)計(jì)2分，Ⅱ級(jí)計(jì)3分，Ⅲ級(jí)計(jì)4分轉(zhuǎn)換為計(jì)量資料。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)VEGF、PEDF蛋白表達(dá)規(guī)律 取包埋好的蠟塊，2 μm連續(xù)切片，放入含10%牛血清白蛋白(BSA)的PBS孵育2 h以封閉非特異位點(diǎn)。封閉后分別加入VEGF一抗（1∶200）和PEDF一抗（1∶200），4℃冰箱過夜，充分洗滌后，用濾紙洗去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加入一定比例的CY3二抗（1∶75），室溫孵育30 min，再洗滌3次后封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。于熒光顯微鏡下觀察。HYP含量測(cè)定按照HYP測(cè)試盒說明書操作（樣本堿水解法）。

1.2.5 PT-RCR檢測(cè)VEGF/PEDF mRNA表達(dá) 采用Trizol一步法提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以cDNA為模板，在反應(yīng)體系中加入目的基因和內(nèi)參照基因的引物，設(shè)定參數(shù)，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。目的基因和內(nèi)參照基因的引物序列：VEGF-F 5'-ACTCAATGCATGCCACGTGA-3',VEGF-R 5'-GCTGCCTGACACTGTGGTAATG-3'，擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 332 bp；PEDF-F 5'-ACGATACGGCTTGGACTCTGA-3'，PEDF-R 5'-AGACTTGGTAAGTTCGCCTTCG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度 232 bp；內(nèi)參 （GADPH） -F 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GADPH-R 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度440 bp。反應(yīng)條件：94℃2 min進(jìn)入循環(huán)，94℃30 s，59℃45 s，72℃1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min。PCR的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較，如方差齊用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Games-Howell檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 纖維化等級(jí)評(píng)分 各組3、7、14及28 d纖維化程度評(píng)分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中28 d時(shí)，SSd大、小劑量組與BLM組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

Table 1 Comparison of scores of pulmonary fibrosis grading between four groups表1 各組給藥后纖維化程度評(píng)分比較 （分）

Table 1 Comparison of scores of pulmonary fibrosis grading between four groups表1 各組給藥后纖維化程度評(píng)分比較 （分）

*P<0.05，**P<0.01

組別Cont組（1）BLM組（2）SSd大劑量組（3）SSd小劑量組（4）F P（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）n5 5 5 5 3 d 1.00±0.00 2.00±0.35 1.70±0.57 1.80±0.57 4.882*0.011 0.755 0.906 0.992 7 d 1.00±0.00 2.60±0.42 2.20±0.57 2.50±0.50 14.467**0.004 0.609 0.985 0.813 14 d 1.00±0.00 3.10±0.42 2.70±0.27 2.80±0.27 55.385**<0.001 0.041 0.116 0.587 28 d 1.00±0.00 3.80±0.27 2.90±0.42 3.00±0.35 75.156**<0.001<0.001 0.001 0.613

2.2 小鼠肺組織HYP檢測(cè)結(jié)果 BLM組肺組織勻漿HYP水平從第3天開始升高，到第28天達(dá)高峰，與Cont組各時(shí)點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。7、14及28 d時(shí)SSd大、小劑量組與BLM組HYP含量變化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。14、28 d時(shí)SSd大、小劑量組間含量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

Table 2 Contents of HYP in four groups表2 各組肺組織勻漿HYP含量變化 （mg/g肺濕重）

Table 2 Contents of HYP in four groups表2 各組肺組織勻漿HYP含量變化 （mg/g肺濕重）

**P<0.01

組別Cont組（1）BLM組（2）SSd大劑量組（3）SSd小劑量組（4）F P（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）n5 5 5 5 3 d 0.75±0.03 0.92±0.04 0.85±0.04 0.88±0.04 12.467**<0.001 0.038 0.235 0.305 7 d 0.73±0.04 1.15±0.05 0.89±0.05 0.90±0.04 62.577**<0.001<0.001<0.001 0.689 14 d 0.76±0.03 1.25±0.05 0.96±0.03 1.04±0.05 67.21**<0.001<0.001<0.001 0.043 28 d 0.76±0.02 1.58±0.06 1.17±0.08 1.26±0.06 127.870**<0.001<0.001<0.001 0.038

2.3 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 BLM組及SSd大小劑量組VEGF蛋白表達(dá)從第3天開始增加，在第7天達(dá)到高峰，第14、28天呈逐漸下降趨勢(shì)；VEGF蛋白的表達(dá)在纖維化增殖病灶內(nèi)較少，而在非纖維增殖病灶區(qū)域內(nèi)表達(dá)增多，見圖1。BLM組及各SSd組PEDF蛋白的表達(dá)，總體上呈現(xiàn)隨時(shí)間增加而逐漸增多的趨勢(shì)；在區(qū)域上，纖維化程度較重的區(qū)域內(nèi)，表達(dá)明顯增多，而在纖維化程度較輕的區(qū)域，表達(dá)減少，見圖2。

2.4VEGF、PEDF mRNA基因RT-PCR檢測(cè)

2.4.1 PEDF mRNA的表達(dá) BLM組PEDF mRNA表達(dá)在第3、7、14、28天表達(dá)總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在第3、7天，基因表達(dá)水平仍低于Cont組（P<0.01）；SSd大、小劑量組各時(shí)點(diǎn)較BLM組PEDF mRNA表達(dá)水平升高，其中第7、14及28天差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），SSd大、小劑量組于第7、14天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3、圖3。

Table 3 The expression of PEDF mRNA in different groups表3 各組PEDF mRNA表達(dá)情況

2.4.2 VEGF mRNA的表達(dá) BLM組VEGF mRNA表達(dá)從第3天開始增高，于第7天達(dá)到高峰，在第14、28天又逐漸下降，各時(shí)點(diǎn)其水平與Cont組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SSd大、小劑量組各時(shí)點(diǎn)較BLM組VEGF mRNA水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）,SSd大、小劑量組第7、14天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4、圖4。

Table 4 The expression of VEGF mRNA in different groups表4 各組VEGF mRNA表達(dá)情況

Figure 4 Agar electrophoresis of VEGF mRNA in different groups圖4VEGF mRNA瓊脂凝膠電泳圖

3 討論

肺纖維化是一組多因素疾病，使用單一拮抗劑往往效果不佳，而一些中藥常具有多種生物學(xué)成分，具有多通道、多靶點(diǎn)治療復(fù)雜疾病的優(yōu)勢(shì)，并且對(duì)于全身的不良反應(yīng)較小，因此，本研究選擇研究SSd對(duì)其抗肺纖維化的作用。筆者曾研究了SSd對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用[3]，王寶峰等[4]也對(duì)其抗腫瘤血管生成方面做了報(bào)道。研究表明，微血管的生成活性、肺動(dòng)脈高壓和肺纖維化病變的生成與總體預(yù)后有著密切聯(lián)系[8]。VEGF/PEDF在不同層面上互相調(diào)節(jié)互相抑制的作用是體內(nèi)微血管達(dá)到平衡狀態(tài)的重要因素之一[6]。VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞強(qiáng)有力的細(xì)胞因子，其在肺內(nèi)可由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，也可由肺間質(zhì)細(xì)胞分泌[7]。在肺纖維化過程中，VEGF的大量分泌促進(jìn)新的血管形成，并且提高了血管的通透性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)滲出，促進(jìn)纖維化發(fā)展[8]，另外，VEGF還聯(lián)同TGF-β1一起，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，直接促進(jìn)纖維化的發(fā)展[1]。在肺纖維化病灶內(nèi)，VEGF的降低通常伴有PEDF的升高。PEDF主要在氣道、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[9]。PEDF包含2個(gè)相應(yīng)的功能抗原決定簇，34肽和44肽。34肽是負(fù)責(zé)抗血管生成方面的作用，可能連接于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體[10]。PEDF具有強(qiáng)烈的抑制血管生成的作用，能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成，并且能夠誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。但是其直接在肺纖維化中的作用并不十分清楚，Zamiri等[12]研究認(rèn)為，受損的上皮細(xì)胞表達(dá)PEDF在纖維化中很可能抑制成纖維細(xì)胞活性和局部炎癥。

本研究結(jié)果顯示，BLM組及SSd大、小劑量組的VEGF表達(dá)在第3天開始升高，到第7天達(dá)高峰，之后逐漸下降；PEDF的表達(dá)從第3天開始，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，到28天達(dá)高峰，表明肺纖維小鼠中VEGF/PEDF的平衡被打破，提示其血管生成活性的一種趨勢(shì)為早期活性升高，后期活性下降，與文獻(xiàn)[13]相似。SSd大、小劑量組28 d時(shí)纖維化程度評(píng)分和HYP含量與BLM組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明肺纖維化程度明顯減輕，SSd可以通過下調(diào)VEGF的表達(dá)，上調(diào)PEDF表達(dá)抑制纖維化的進(jìn)展。這種調(diào)節(jié)作用隨著SSd劑量的增大而增強(qiáng)。結(jié)合本研究，筆者認(rèn)為其抑制纖維化的原因可能為：（1）SSd調(diào)節(jié)VEGF/PEDF的平衡向抑制血管活性方向移動(dòng)，通過抑制微血管的形成延緩纖維化的進(jìn)展。（2）其下調(diào)VEGF的表達(dá)，直接抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，抑制肺纖維化的發(fā)展。（3）其上調(diào)了PEDF的表達(dá)，也有利于抑制成纖維細(xì)胞的活性。

因此，筆者認(rèn)為，SSd可以通過調(diào)節(jié)VEGF/PEDF的作用，明顯抑制肺纖維化的進(jìn)展，減輕肺纖維化的程度；但對(duì)于肺內(nèi)嚴(yán)重纖維化，SSd治療仍有風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)加重肺動(dòng)脈高壓的癥狀。另外，根據(jù)肺纖維化進(jìn)程中血管生成總體活性先升高后降低的變化，以及其分別在肺纖維病程中的作用，筆者推測(cè)，對(duì)肺纖維化疾病分階段治療，或許能成為以后研究的方向之一。

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The Effect of Saikosapoin-d Intervention on VEGF/PEDF Expression in Experimental Pulmonary Fibrosis in Mice

ZHENG Jinxu，XU Qing，GUAN Shuhong，LIU Jizhu，SONG Ping，TANG Yan，WU Liyang

Department of Respiratory Medicine,The Affiliated Hospital of Jiangsu University,Jiangsu 212001,China

Objective:To investigate the effect of saikosapoin-d（SSd）on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)/pigment epithelium-derived factor(PEDF)in lung tissue at different times,and to explore its relationship with anti-fibrosis in mice.Methods：Eighty mice were randomly divided into four groups:control group，model group(bleomycin,BLM)and two treatment groups(P<0.01)．Mice in treatment groups were injected intraperitoneally with SSd at different dos?es（2.0 mg/kg and 1.0 mg/kg）once per day．Samples of lung tissue were stained with Masson method.Hydroxyproline(HYP)content was evaluated.The expressive levels of VEGF and PEDF mRNA were observed by immunofluorescence.The expres?sive intensity of VEGF and PEDF mRNA was detected by RT-PCR at the 3 th，7 th，14 th and 28 th day．Results：In model group and SSd treatment groups,fibrosis was found gradually progressed,which was minor on 28 th day in SSd treatment group than that of BLM group(P<0.01).HYP levels increased gradually in BLM group and SSd group.HYP contents were lower on the 7 th，14 th and 28 th day in SSd treatment group than those of BLM group(P<0.001)．The expression of VEGF increased from the third day and reached the peak on the 7 th day in BLM group and SSd group.Then the expression of VEGF gradually decreased and reached the lowest level at 28 th day.The expression of PEDF presented tendency of elevation gradu?ally．In treatment groups，the expression of VEGF was lower than that in model group.The expression of PEDF mRNA was higher in SSd group than that in model group(P<0.05 or P<0.01)．Conclusion：SSd can inhibit pulmonary fibrosis in mice,which may be related to the down-regulation of VEGF and up-regulation of PEDF.

SAIKOSAPONIN pulmonary fibrosis vascular endothelial growth factors bleomycin hydroxyproline RNA,messenger disease models,animal

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.014

*上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：10ZR1422600）；衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：WKJ2006-2-026）

212001 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科

（2011-12-27收稿 2012-03-02修回）

（本文編輯 陸榮展）