高效液相色譜法測定乳制品中的葉黃素

高迎春，尹伶靈，陳玲，陸慶泉，牛華星，張呈軍，魏秀麗

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022)

高效液相色譜法測定乳制品中的葉黃素

高迎春，尹伶靈，陳玲，陸慶泉，牛華星，張呈軍，魏秀麗

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022)

建立了一種簡單、快速、可靠的測定乳制品中葉黃素的新方法。乳制品中的葉黃素經(jīng)正己烷提取，氮?dú)獯抵两?，殘余物用正己烷－乙酸乙酯?0+30）溶解后，高效液相色譜法測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，在不同乳制品中添加回收率范圍為91.0%～102.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.64～2.92。該方法的檢出限和最低定量限分別為20 μg/kg和50 μg/kg。

乳制品;葉黃素;高效液相色譜法

0 引 言

葉黃素(Lutein)是一種含氧的類胡蘿卜素，在自然界中與玉米黃素共同存在，廣泛存在于香蕉、獼猴桃、玉米和萬壽菊中[1]。葉黃素具有很多重要的生理活性，如抗氧化、抗衰老、抗癌等。但是人體內(nèi)不能自身合成葉黃素，只能從食物中攝取。通過補(bǔ)充葉黃素可以減少心血管病的發(fā)病率[2]，保護(hù)視力，預(yù)防近視、老年性白內(nèi)障和老年黃斑變性的發(fā)生[3-4]。目前已有的乳制品中葉黃素的測定方法還比較少[5-6]，而且都存在一定的缺陷（適用范圍窄，前處理復(fù)雜等）。因此，一種簡單、快速、適應(yīng)性好的可用于乳制品中葉黃素測定的方法亟待開發(fā)。本文建立了一種測定乳制品中葉黃素的新方法，乳制品中的葉黃素經(jīng)正己烷提取后，高效液相色譜法測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器

高效液相色譜儀（配紫外檢測器）；MP200B天平，臺式高速冷凍離心機(jī)，XW-80A渦旋混合器，HY-4調(diào)速多用振蕩器。

1.2 試劑

葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為96.2%）；正己烷，乙酸乙酯，二氯甲烷均為色譜純；海砂（分析純）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取10.0 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷溶解并定容至10 mL容量瓶中，在 -80℃冰箱中避光保存，有效期一個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取質(zhì)量濃度為1 g/L葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL用流動(dòng)相（正己烷-乙酸乙酯（體積比，70+30））稀釋定容至100 mL容量瓶中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 方法

1.4.1 樣品預(yù)處理

（1）液體試樣。準(zhǔn)確稱取試樣適量（精確到0.0001 g，試樣中含葉黃素0.1 g以上），置50 mL具塞離心管中。在避光條件下，加入15 mL正己烷，充分混勻，振蕩提取15 min，離心10 min，取上清液于另一離心管中。殘?jiān)偌诱和?0 mL，重復(fù)提取一遍，合并兩次上清液于同一50 mL離心管中，50℃下氮?dú)獯抵两?。殘余物用正己烷－乙酸乙酯（體積比，70+30）溶解并定容至1.00 mL，用孔徑0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾，供高效液相色譜分析。

（2）固體試樣。準(zhǔn)確稱取試樣適量（精確到0.0001 g，試樣中含葉黃素0.1 g以上）于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中。用10 mL正己烷分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中。以下步驟按1.4.1（1）的 “振蕩提取15 min，……”操作。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：正相硅膠柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），粒徑5 μm，或相當(dāng)者；流動(dòng)相為正己烷-乙酸乙酯（體積比，70+30）；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為445 nm；進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

通過查閱文獻(xiàn)[7,8]和實(shí)驗(yàn)分析，我們最終選定了正相硅膠柱，紫外檢測器。而文獻(xiàn)報(bào)道中正相柱多采用環(huán)己烷-乙酸乙酯，丙酮等為流動(dòng)相，經(jīng)過多次試驗(yàn)，我們將流動(dòng)相中的環(huán)己烷、丙酮換成實(shí)驗(yàn)室常用的正己烷，最終確定流動(dòng)相為正己烷-乙酸乙酯。 然后，通過配制不同比例的正己烷-乙酸乙酯溶液作為流動(dòng)相，分別將不同乳制品中添加葉黃素后進(jìn)樣。發(fā)現(xiàn)以正己烷-乙酸乙酯（70+30）為流動(dòng)相時(shí)出峰時(shí)間較合適（13.652 min），不僅分離效果好，而且峰形也非常好（圖1～圖6）。

2.2 提取溶劑的選擇

由于葉黃素易溶于二氯甲烷、正己烷、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑，故選擇這4種溶劑提取試樣中的葉黃素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用二氯甲烷、乙醚提取時(shí)，葉黃素提取不完全，回收率較低；而丙酮回收率高但其毒性大、氣味刺激；用正己烷提取時(shí)，葉黃素提取完全，回收率高，最終我們選擇正己烷為提取溶劑。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用正己烷-乙酸乙 酯 （70+ 30） 稀 釋 成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0.05，0.10，0.20， 0.50，1.00，2.00 mg/L的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測定。以葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為y=286530x+16921，相關(guān)系數(shù)為R=0.9995。通過數(shù)據(jù)可以看出，本方法具有良好的線性響應(yīng)。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在空白巴氏殺菌乳、酸乳、奶粉、奶酪、干酪、煉乳中添加不同濃度的葉黃素進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測定6次，求相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表1所示，在不同乳制品中，添加回收率范圍為91.0%～102.6%，可以看出本方法的準(zhǔn)確度符合乳制品中葉黃素的檢測要求。6次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍為0.64～2.92，證明表1本方法具有較好的精密度。

2.5 方法的檢出限和定量限

通過加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別以3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限和最低定量限。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 μg/kg時(shí)，葉黃素峰信噪比（S/N）均＞3，確定為方法的檢測限；添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50μg/kg時(shí)，信噪比（S/N）均＞10，確定為方法的最低定量限。

表1 不同乳制品中葉黃素的回收率測定結(jié)果（n=6）

3 結(jié) 論

本文建立的測定乳制品中葉黃素含量的高效液相色譜法，其前處理簡單、色譜條件易于實(shí)現(xiàn)，測試數(shù)據(jù)重復(fù)性好，回收率高，精密度和準(zhǔn)確度均能滿足食品理化分析的要求，適用于乳制品中葉黃素含量的日常檢測。

[1]惠伯棣.類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M].北京：中國輕工出版社，2005.

[2]盧艷杰.黃體素、玉米黃質(zhì)及其生理功能研究現(xiàn)狀[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003(2):80-84.

[3]OLMEDILLA B,GRANADO F,BLANCO I,et al.Journal of the Science of Food and Agriculture[J].2001,81(9):904-909.

[4]尤新.葉黃素及其護(hù)眼功能[J].中國食品添加劑，2003(5):1-3.

[5]奶粉中葉黃素的測定液相色譜一紫外檢測法[S].中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 23209-2008.

[6]黃菲菲.乳與乳制品中葉黃素的測定—高效液相色譜法[J].中國乳品工業(yè)，2010（6）：54-59.

[7]張莉華.HPLC法測定食品中的葉黃素含量[J].中國食品添加劑，2006（5）：159-162.

[8]飼料中葉黃素的測定—高效液相色譜法[S].中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 23187-2008.

Determination of lutein in dairy products by high performance liquid chromatography

GAO Ying-chun,YIN Ling-ling,CHEN Ling,LU Qing-quan,NIU Hua-xing,ZHANG Chengjun,WEI Xiu-li
（Shandong Provincial Veterinary Medicine,Jinan 250022,China）

A simple fast and reliable method has been developed for the determination of lutein in dairy products.The samples were extracted by n-hexane,blown nearly dry with nitrogen.The residue was dissolved by n-hexane-ethyl acetate (70+30),and the final solution was determined by HPLC.The method was quantified by calibration curve method.The method has good accuracy and precision.The recovery of lutein in dairy products was 91.0%～102.6%.The relative standard deviations(RSD)was 0.64～2.92.The detection limits of lutein was 20 μg/kg,and the quantification limits was 50 μg/kg.

dairy products;lutein;high performance liquid chromatography

TS252.7

A

1001-2230（2012）04-0048-03

2011-12-07

高迎春（1957-），女，研究員，主要從事獸藥和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)及研究工作。