THADA，PDLIM5，SLC22A3和染色體17q24區(qū)多態(tài)性與中國北京人群前列腺癌的關(guān)聯(lián)性研究

王 鋼 焦海燕 楊 闊 徐 勇 楊一歌 霍正浩 楊 澤 王建業(yè)※

2寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)教研室 750004

3天津醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 300211

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界老年男性最常見的腫瘤類型，預(yù)計在2011年美國男性癌癥診斷超過24萬新病例［1］。我國PCa患病率過去一直較低，近年來隨著人口老齡化增加、生活水平及醫(yī)療診斷技術(shù)的提高，PCa患病率緩慢增長。以上海為例，前列腺癌每年新發(fā)病例數(shù)由1984～1989年的1.833人/10萬人口上升至2005年的9.59人/10萬人口［2］。PCa已位居我國男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，成為影響我國45歲以上男性生活質(zhì)量和預(yù)期壽命的重要疾病之一［3］。

北京的前列腺癌發(fā)病率類似于上海［4］。年齡、種族及地理因素等都是構(gòu)成前列腺癌的風(fēng)險因素［5］。然而，這些因素都可能無法完全解釋前列腺癌發(fā)病率的不同人群之間的差異。因此，在特定的基因，包括8q24區(qū)域的活性基因控制，遺傳變異，可以發(fā)揮對前列腺癌易感性的不確定性作用。2012年3月至2012年8月，我們對北京市居民中PCa患者和正常對照者 THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(qū)(rs1859962)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并分析PCa患者中基因型和表型(臨床、遺傳、膳食習(xí)慣、嗜好等)的關(guān)系。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:PCa患者來自衛(wèi)生部北京醫(yī)院泌尿外科，共112例，年齡(50～85)歲，平均年齡74歲，PSA值為0.1 ～1000.0 ng/ml，平均 37.6 ng/ml，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。對照組91例，篩選自本院體檢中心的常規(guī)體檢人群，均為男性，無PCa和其他腫瘤家族史，PSA值0～3.6ng/ml，平均1.4ng/ml，并經(jīng)直腸指診和B超等檢查排除PCa，年齡(60～88)歲，平均年齡72歲，與 PCa組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。研究對象均簽署知情同意書，研究程序經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑:全基因組DNA提取試劑盒購自博爾誠(北京)科技有限公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司;飽和熒光染料購自美國Idaho公司。引物由生工生物(上海)有限公司合成;基因測序由華大基因公司完成。

1.1.3 主要儀器:PCR擴增儀為美國MJ公司的PTC.225型PCR儀;高分辨熔解曲線(high resolution melting，HRM)基因突變/基因分型檢測系統(tǒng)為美國Idaho公司的Lightscanner TMHR-I96;DNA定量分析儀為德國Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio.Rad公司的Gel DOC-2000成像系統(tǒng)。離心機為美國Beckman公司的AllegraTM21R型離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量:按試劑盒具體名稱說明書進(jìn)行操作。樣本DNA置4℃保存。

1.2.2 PCR 反應(yīng):從 Gene bank 中查取 rs1465618，rs17021918，rs7679673和rs1859962附近的基因序列，引物設(shè)計通過Oligo6.0和Primer 5.0軟件完成。

rs1465618上游引物5′-TCTGGTAGAGCTTGGTAAGTCC-3′，下游引物 5′-ATATTGTGAAGCCTTGGTG-3′，退火溫度59℃;rs17021918 上游引物 5′-GCTGCTATTTTTCCTT-3′，下游引物 5′-TTACTAAGCAGGTGCTC-3′，退火溫度 50℃;rs7679673 上游引物 5′-GCCAAGATTATAGGAA-3′，下游引物 5′-TCATGGGAAAATTCTAC-3′，退 火 溫 度 50℃;rs1859962 上游引物 5′-AGACTTTTCCAAATCCCTG-3′，下游引物5′-GCCCCATTATTAGAAATCTTG-3′，退火溫度 54℃;低溫內(nèi)參上游引物5′-TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA-C3，下游引物 5′-TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3。高溫內(nèi)參上游引物 5′-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGGGAAGCGGAGGGGCGGG-C3，下游引物5′-CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3。寡核苷酸內(nèi)參末端用C3封閉，以阻止延伸反應(yīng)。

PCR 反應(yīng)體系10μl，包括 DNA 模板1μl，10 ×PCR Buffer 1μl，10mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物(10pmol/μl)各 0.1μl，1 × 飽和熒光染料 0.8μl，寡核苷酸內(nèi)參總共0.15μl(包括高溫寡核苷酸內(nèi)參與低溫寡核苷酸內(nèi)參4個片段)，去離子水補充總體積至10μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5分鐘后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸6秒，共35個循環(huán)，72℃延伸7分鐘。之后進(jìn)行HRM分析前的變性和復(fù)性處理，95℃ 30秒，25℃2分鐘，94℃ 30秒，24℃ 4分鐘。

1.2.3 HRM檢測:將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Lightscanner TMHR-I 96上進(jìn)行HRM分析:從40℃開始，以0.3℃/秒的斜率采集熔解曲線。到98℃結(jié)束，用LightScanner Call IT軟件對采集后的曲線進(jìn)行分析，判定基因型。

1.2.4 測序驗證:基因分型采用根據(jù)HRM分析的不同陸線確定不同的基因型，從所得的不同基因型的個體中分別隨機抽取5例樣本進(jìn)行測序驗證。測序樣本重新進(jìn)行PCR擴增，測序引物為:rs1465618上游引物 5′-CCTAAAGCCAAAACAGCA-3′，下 游 引 物 5′-AGTTCCAAAGAATGAAGACC-3′，退火溫度53℃;rs17021918 上游引物5′-ACCTCCCAAGGTAACCTC-3′，下游引物 5′-TTTCTCCCCATAACCACTA-3′，退火溫度 52℃;rs7679673 上游引物 5′-TGTACCTTGAGGTTTACAGATC-3′，下 游引 物 5′-CCCTAAAAGGAACACACAG-3′，退火溫度 53℃;rs1859962 上游引物 5′-CCTTGGACCAGTTCTTGA-3′，下游引物 5′-GGGAAATTTAGCCCCATTAT-3′，退火溫度55℃。PCR反應(yīng)體系50μl:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去離子水補充總體積至 50μl。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入主循環(huán)，95℃變性30秒，退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)，之后72℃延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察合格后，送華大基因公司測序驗證。

圖1 8q24基因rs1465618，rs17021918，rs7679673和 rs1859962HRM分型圖(HRM曲線)

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)。運用Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗研究樣本的群體代表性。用比數(shù)比(OR)值及其95%置信區(qū)間評價相對風(fēng)險。計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U秩和檢驗，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用 Fisher′s或 Pearson′s χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用SHEsis軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，以P＜0.05說明存在連鎖不平衡。

2.結(jié)果

2.1 HWE定律吻合度檢驗 經(jīng)HWE檢驗，在對照組中rs1465618，rs17021918，rs7679673 和 rs1859962多態(tài)性位點的基因型頻率P＞0.05，表明研究來自同一群體，具有較好的群體代表性。

2.2 分型結(jié)果 通過 HRM基因分型系統(tǒng)，SNPs rs1465618，rs17021918，rs7679673 和 rs1859962均有 3種基因型，每種基因型的溶解曲線差異非常明顯(圖1)。在每種基因型攜帶者中選5例進(jìn)行測序驗證給出至少一個測序圖表，進(jìn)行基因型的確定以及HRM分型結(jié)果準(zhǔn)確性的評估。HRM分型的結(jié)果與測序的結(jié)果完全吻合，準(zhǔn)確率為100%。測序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上BLAST比對，序列完全一致。

2.3 PCa候選基因關(guān)聯(lián)分析 rs1465618，rs17021918，rs7679673和rs1859962的基因型和等位基因型在PCa組和對照組間的分布均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果見表1。

2.4 PCa相關(guān)質(zhì)量表型和基因型的關(guān)聯(lián)分析 依照PCa

患者的質(zhì)量性狀(表型)，包括患者的臨床特征、PSA、年齡、腫瘤分期和煙酒等8類觀察指標(biāo)，這些指標(biāo)與這4個SNPs位點的各基因型都無關(guān)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。為檢測PCa關(guān)聯(lián)基因型的遺傳模型，我們采用了顯性和隱性兩種模型表中只有一種模型數(shù)據(jù)分析。

表1 THADA、PDLIM5、SLC22A3和染色體17q24區(qū)4個SNPs的基因型和等位基因在PCa組和對照組中的分布

表2 PCa患者表型與4個基因型的關(guān)聯(lián)分析

3.討論

近年來，隨著中國人口老齡化以及生活條件的改善，PCa的發(fā)病率呈顯著的上升趨勢，已經(jīng)成為中國老年男性最常見的惡性腫瘤之一。PCa的遺傳流行病學(xué)發(fā)現(xiàn):許多因子包括遺傳和膳食因素被證明與PCa的發(fā)生密切相關(guān)，PCa位居第4位，僅次于唇黑色素瘤，皮膚黑色素瘤和卵巢癌［6］。由此可見，遺傳因素在PCa的發(fā)生中起著重要的作用。

PCa的具體病因仍然不清，主要危險因素有老年、家族史和遺傳等。年齡因素是不可變因素，腫瘤發(fā)生與衰老和機體退行性變有關(guān)，如，PCa在＜45歲人群中罕見，但隨年齡增長，PCa發(fā)病率逐漸增加，PCa患者的平均診斷年齡為70歲［7］。尸檢研究揭示，50歲男性中PCa患者占30%，70歲男性約80%患PCa［8］。另一不可變因素是遺傳因素。

THADA基因位于染色體2p21上，最早被發(fā)現(xiàn)是甲狀腺腺瘤靶基因，與甲狀腺腺良性腫瘤相關(guān)［9］;PDLIM5(PDZ and LIM domain 5)，這是由于該基因其他剪接體的編碼蛋白N端含有PDZ功能域，C端含有三個LIM功能域，定位在4號染色體4q22-23上［10］;SLC22A3位于人類6號染色體上，編碼運送陽離子有機化合物的載體蛋白，作用于強心劑中兒茶酚胺［11］，并且對陽離子藥物例如二甲雙胍作用于心肌層有重要意義;染色體17q24區(qū)域Sox9(SRY-related high mobility group-box gene9)基因是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因，是與位于男性Y染色體上的SRY基因(Sex determine region of Y chromosome)同源的家族基因。而SRY基因不是直接調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育而是通過Sox9共同作用才發(fā)生作用［12］。本研究聯(lián)合分析 THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(qū)(rs1859962)4個重要的PCa相關(guān)基因，并觀察了各自貢獻(xiàn)PCa發(fā)生風(fēng)險的獨立作用。雖然每一基因均有多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，但在遺傳病因?qū)W研究中，通常在證據(jù)(文獻(xiàn)報道和預(yù)實驗等)基礎(chǔ)上選擇候選基因，作為疾病關(guān)聯(lián)研究的策略之一，本組也采用了同樣的研究策略。但本研究表明THADA(rs1465618)、 PDLIM5(rs17021918)、 SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(qū)(rs1859962)與中國北京PCa患病風(fēng)險無相關(guān)性(P＞0.05)，而且基因型與部分表型分析表明與PCa患者的年齡、Gleason評分、PSA濃度及煙酒等均無相關(guān)性(P ＞0.05)。

由于本研究存在樣本量較小這一局限性，對于THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(qū)(rs1859962)和與中國北京人PCa發(fā)生相關(guān)性的最終定論，還需在其他群體的更大樣本中進(jìn)行進(jìn)一步驗證，以便為PCa的病因?qū)W研究奠定理論基礎(chǔ)。

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