中國X連鎖無丙種球蛋白血癥40例基因型表型相關性分析

王 瑩 應文靜 孫金嶠 劉丹如 俞曄珩 王靜漪 王曉川

原發(fā)性低丙種球蛋白血癥是原發(fā)性免疫缺陷病中最常見的一組疾病，其中X連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)是常見類型之一[1]。XLA是一種典型的B細胞缺陷病，絕大多數(shù)患者的臨床表現(xiàn)為出生后不久即出現(xiàn)反復而嚴重的細菌感染、低丙種球蛋白血癥及外周血B細胞的顯著減少或缺乏[2]。然而多年的研究發(fā)現(xiàn)，XLA患者B細胞缺陷在分化發(fā)育中表現(xiàn)程度存在差異，因而反映在患者的臨床表現(xiàn)也存在明顯的差異。雖然研究表明XLA患者的平均確診年齡是26個月，但仍有不少XLA患者直至成年后才得以診斷，且無明顯的臨床表現(xiàn)[3]。如何解釋這種差異已成為近年來國際上關注的研究方向。

1993年，Vetrie等[4]通過定位克隆的方法找到了XLA的致病基因——Bruton′s酪氨酸激酶(BTK)基因 。截至2007年，根據(jù)國際BTK基因突變數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，全球已有620多種突變被報道，且沒有一種突變的發(fā)生率超過3%[5]。目前，尚無研究證實XLA的疾病表型與基因型間存在明確的相關性，但XLA患者不同的BTK基因突變類型仍可能是影響疾病嚴重程度的因素之一[6,7]。2003至2011年，本研究通過對臨床擬診為原發(fā)性低丙種球蛋白血癥患兒檢測BTK蛋白表達和(或)BTK基因分析，確診了40例XLA，并從確診年齡、臨床表現(xiàn)、免疫學功能、BTK蛋白表達及基因型等方面進行較為深入的分析，結果報道如下。

1 方法

1.1 病例來源 復旦大學附屬兒科醫(yī)院臨床免疫科從2003年起建立了先天性免疫缺陷病的診斷流程，其中XLA的流程如下：對反復細菌感染、不明原因發(fā)熱的臨床懷疑XLA的患兒，行常規(guī)免疫功能評價(血清免疫球蛋白水平，T、B細胞數(shù)量)，對臨床擬診XLA的患兒建立隨訪數(shù)據(jù)庫(聯(lián)系方式和臨床資料的采集)，進行至少包括患兒及其母親的BTK基因分析，有條件者行流式細胞檢測BTK蛋白表達[根據(jù)日本富山醫(yī)科藥科大學醫(yī)學部小兒科 Miyawaki Toshio教授贈送抗BTK單克隆抗體(48-2H)的數(shù)量決定行這一檢測的患兒數(shù)量]。

1.2 臨床擬診XLA標準 ①外周血CD19+的B細胞數(shù)量<2%；②血清免疫球蛋白水平<3 g·L-1；③反復較嚴重的細菌感染；④伴或不伴有XLA陽性家族史。

1.3 常規(guī)免疫功能評價 血清免疫球蛋白測定采用散射比濁法，使用免疫球蛋白TURBOX試劑盒(Orion Corpo-ration Orion Diagnostica, Espoo, Finland)， T、B細胞分化簇(CD)測定使用熒光標記的抗CD19、抗CD3、抗CD4和抗CD8單克隆抗體 (BD Biosciences, San Jose, CA)，結果采用Multiset軟件分析。

1.4BTK基因突變檢測BTK基因突變的檢測方法根據(jù)Kanegane等[7]報道,簡述如下：TRIzol (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA)抽提外周血單個核細胞(PBMC)總RNA，5 μg總RNA Invitrogen ThermoSciptTM使用 RT-PCR System (Invitrogen Life Tech-nologies, NY，USA)作用下逆轉錄獲得cDNA。使用8對重疊的引物分2步擴增BTKcDNA。使用QIAGEN血液DNA抽提試劑盒(QIAGEN,USA)基因組DNA，一系列根據(jù)BTK基因外顯子序列設計的引物用于DNA PCR。PCR產物經堿性磷酸酶(SAP)(Fermentas, USA)純化后直接測序。測序反應使用BigDye Terminator Cycle Sequencing 試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)，產物經純化后使用ABI PRISM 3130 DNA測序儀(Applied Biosystems)進行測序。由cDNA PCR產物測序發(fā)現(xiàn)的BTK突變，經相對應部位的DNA 序列PCR產物進行測序進一步證實?；純耗赣H及家族中部分親屬DNA也在相應部位擴增并測序。

1.5 流式細胞儀檢測單核細胞BTK蛋白表達 采集患兒及其家庭成員肝素抗凝的外周血，F(xiàn)icoll-Hypaque (Sigma, USA) 密度梯度離心分離外周血單個核細胞。使用48-2H標記細胞內BTK[8]。具體步驟：使用PE標記的抗CD14 (IgG2a; DAKO, Kyoto, Japan) 單克隆抗體加入PBMC，冰浴20 min。4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。0.1%TBS Triton X-100 (pH 7.4)含0.1%BSA破膜5 min。加入2 μg·mL-148-2H或IgG1 (DAKO)單克隆抗體，冰浴20 min；洗滌后加1∶2 000稀釋的FITC標記的羊抗小鼠IgG1 (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)，冰浴20 min。流式細胞儀采用CellQuest軟件采集并分析結果。

2 結果

2.1 一般情況 2003年1月至2011年5月復旦大學附屬兒科醫(yī)院臨床免疫科共連續(xù)收集來自47個家族的50例男性原發(fā)性低丙種球蛋白血癥患兒。40例確診XLA患兒起病年齡、確診年齡和免疫表型見表1。

2.2 XLA患兒BTK基因突變類型及特點 50例臨床擬診為原發(fā)性低丙種球蛋白血癥患兒行基因分析，其中40例(80%)BTK基因存在突變，確診為XLA，14/40例為未見報道(http://www.uta.fi/imt/bioinfo/BTKbase/)的新突變(表1)。40例基因突變包括：16例(40.0%)錯義突變，13例(32.5%)無義突變,4例(10.0%)插入突變，4例(10.0%)缺失突變和3例(7.5%)剪接突變。8例位于CpG位點(R13X、R28C、R255X、R520X、R525P、R562L各1例，R525Q 2例)。40例基因突變分布于整個BTK基因編碼區(qū)域，其中20例(50.0%)位于激酶(TK)區(qū),9例(22.5%)位于PH區(qū),3例(7.5%)位于TH區(qū),3例(7.5%)位于SH3區(qū)，5例(12.5%)位于SH2區(qū)(表2，圖1)。21/40例(52.5%)被證實第18號外顯子2031位堿基存在C/T多態(tài)性，其他BTK基因數(shù)據(jù)庫中報道的多態(tài)性未在本研究對象中檢測到(表1)。

表2 40例XLA患兒BTK基因突變類型及結構域分布[n(%)]

Tab 2BTKmutation types and distribution in BTK protein domain[n(%)]

DomainMissenseNonsenseInsertionDeletionSplice-siteTotalTK11511220PH321219TH012003SH3030003SH2220105Total16(40.0)13(32.5)4(10.0)4(10.0)3(7.5)40

Notes PH: pleckstrin homology;TH :Tec homology;SH:Src homology; TK:Tyrosine Kinase

2.3 臨床表現(xiàn)、確診年齡與基因型關系 表1顯示，XLA患兒均有典型的原發(fā)性低丙種球蛋白血癥的臨床表現(xiàn),即反復發(fā)生的細菌性感染,包括肺炎、中耳炎、腹瀉、骨髓炎、腦膜炎、脊髓灰質炎及皮膚感染。9例(例2,8,13,15,19,31,33,34a和34b)伴有關節(jié)炎。例22還伴發(fā)顏面及球結膜毛細血管擴張。

40例確診XLA患兒起病年齡均≤4歲，24例起病≤1歲。突變類型為錯義突變的患兒平均起病年齡為(1.4±1.1)歲，其他突變類型患兒為(1.4±0.7)歲，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.45)。

40例XLA患兒確診年齡與BTK基因突變類型相關性如表3所示，確診年齡≤3歲9例，～6歲15例，～10歲13例，>10歲3例。結果顯示，錯義突變的發(fā)生率隨年齡的增長呈上升趨勢，無義突變的發(fā)生率呈下降趨勢?！?歲患兒中錯義突變2例(1例位為編碼PH區(qū)第28位氨基酸的CpG位點，1例位于TK區(qū))，1例為位于TK區(qū)的剪接突變。例21和27起病年齡均為2歲，診斷年齡例21為20歲，例27為13歲，均為位于TK區(qū)CpG位點的錯義突變。

圖1 XLA患兒BTK基因突變類型及分布

Fig 1BTKgene mutation types and distribution in protein domain

NotesBTKgene contains 19 exons. BTK protein contains five function domains. All forty cases ofBTKmutation were marked in the figure. Mutation marked with solid black arrows were new types that had not been reported in the BTKbase.PH: pleckstrin homology;TH :Tec homology;SH:Src homology; TK:Tyrosine Kinase. There were 9, 3, 3,5 ,20 cases in PH, TH SH3 SH2 and TK domains

表3 XLA患兒確診年齡與BTK基因突變類型[n(%)]

Tab 3 Age at diagnosis and type ofBTKgene mutation in XLA patients[n(%)]

Diagnosedage/yMissenseNonsenseInsertionDeletionSplice-site0-3(n=9)2(22.2)6(66.7)001(11.1)-6(n=15)6(40.0)4(26.7)2(13.3)2(13.3)1(6.7)-10(n=13)6(46.2)3(23.1)1(7.7)2(15.4)1(7.7)>10(n=3)2(66.7)01(33.3)00

2.4 常規(guī)免疫功能水平與基因型關系 40例確診XLA患兒常規(guī)免疫功能評價均有外周血B細胞顯著減少或缺乏,其中錯義突變13例(32.5%)，無義突變12例(30.0%)。34/40例(85.0%)B細胞<0.1%；4例(10.0%)B細胞在1%～2%，其中錯義突變2例，無義突變1例，剪接突變1例；2例(5.0%)B細胞為2%，均為錯義突變(表1)。

37/40例XLA患兒檢測了血清IgG水平，其中<1 g·L-120例，～3 g·L-116例， >3 g·L-11例。表4顯示，血清IgG<3 g·L-1患兒BTK基因突變類型以錯義突變和無義突變?yōu)橹鳎彝蛔兇蠖辔挥赥K區(qū)(表1)。

例33血清IgG<0.1 g·L-1，其基因突變類型為位于TK區(qū)的錯義突變(L616F)；例27血清IgG>4 g·L-1，其基因突變類型為位于TK區(qū)CpG位點的錯義突變(R562L)(表1)?；蛲蛔冾愋蜑殄e義突變和其他突變類型患兒血清IgG水平分別為(1.43±1.15)和(1.05±0.81)g·L-1，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.25)。

表4 XLA患兒血清IgG水平與BTK基因突變類型[n(%)]

Tab 4 Serum IgG level and type ofBTKgene mutation in XLA patients[n(%)]

SerumIgG/g·L-1MissenseNonsenseInsertionDeletionSplice-site<1(n=20)8(40.0)6(30.0)3(15.0)2(10.0)1(5.0)1-3(n=16)7(43.7)5(31.3)1(6.3)2(12.5)1(6.3)>3(n=1)1(100)0000

2.5 單核細胞BTK蛋白表達水平與基因型關系 13例XLA患兒檢測了單核細胞BTK蛋白表達(表1)，7/13例(53.8%)BTK蛋白表達明顯降低，其中錯義突變3例(42.8%)，無義突變2例(28.6%)，插入突變和缺失突變各1例(14.3%)。余6例單核細胞BTK蛋白表達正常，其中4例(66.7%)突變類型為錯義突變。錯義突變患兒BTK蛋白表達水平為(49.9±45.1)%，其他突變類型為(52.4±50.1)%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.16)。例3的BTK蛋白表達水平正常，為位于PH區(qū)的CpG位點的錯義突變，血清IgG水平為2.9 g·L-1，較其他患兒高(表1)。采用Spearman等級相關分析，XLA患兒單核細胞BTK蛋白表達水平與外周血B細胞數(shù)量(r=0.287)和血清IgG水平(r=0.35)無顯著相關性。

2.6BTK基因多態(tài)性與疾病表型 6/21例(28.6%)2031位堿基存在C/T多態(tài)性患兒(例2、8、31、33、34a和34b)臨床表現(xiàn)除了上呼吸道反復感染外還伴有嚴重的關節(jié)炎，主要表現(xiàn)為關節(jié)損傷、變形；19例無多態(tài)性患兒中3例(15.8%)有關節(jié)炎表現(xiàn)。

2.7 家族遺傳特點分析 32例XLA患兒母親檢測了BTK基因突變，其中28例(87.5%)患兒母親BTK基因為雜合型，證實為攜帶者(表1)。余4例患兒母親基因分析正常，其基因突變可能為新發(fā)突變(denovomutation)。

3 討論

中國從1998年開始原發(fā)性免疫缺陷病登記工作[9]，國內有關XLA的報道多數(shù)為臨床診斷病例。Pamela等[10]報道了包括中國(大陸和香港)和新加坡在內的62例基因確診病例，本課題組前期報道了30例XLA病例[11]。本研究采用BTK基因分析結合流式細胞法檢測單核細胞內BTK蛋白表達，確診了40例XLA[12～14]。本研究結果顯示，中國XLA患兒主要的突變類型為錯義突變，突變主要分布于TK區(qū)和PH區(qū)，而這兩個結構域也是BTK蛋白中最主要的功能區(qū)。根據(jù)國際BTK基因突變數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計信息，本研究結果與全球BTK基因突變類型及在BTK基因中的分布相近[15]。

Pamela等[10]對62例XLA患者的起病年齡進行研究后發(fā)現(xiàn)，突變類型為錯義突變的患者起病年齡明顯高于其他突變類型的患者，而本研究錯義突變患兒的起病年齡與其他突變類型無顯著差異。由于不同地區(qū)的環(huán)境及醫(yī)療條件的差異，部分XLA患兒在初次發(fā)病后未能得到及時的診斷，因而造成了本研究中XLA患兒起病年齡和確診年齡的差異。有研究表明XLA患者的平均確診年齡為26個月[3]，本研究40例XLA患兒平均確診年齡為5.5歲(66月齡)，確診年齡在3歲以下患兒以無義突變?yōu)橹?，確診年齡在6歲以上患兒以錯義突變?yōu)橹?。這與國際上一些大樣本的研究結果一致[10,16]。Broides等[17]診斷110例XLA患兒中有56%診斷年齡在6歲以上者的基因突變類型為錯義突變，且隨著診斷年齡的延遲，錯義突變在患兒中所占的比例也逐漸升高。因此，結合國際上的大樣本研究可見XLA患兒的突變類型可能與疾病的確診年齡有關，而引起單個氨基酸替代改變的錯義突變可能是引起患兒確診年齡延遲的因素之一。起病年齡一般認為可以反映疾病的嚴重程度，但由于是回顧性病史詢問，較難客觀。而確診年齡受到包括醫(yī)療條件、經濟條件、認知度以及疾病嚴重程度等多方面的影響，也可以一定程度反映疾病的嚴重程度。

XLA患兒外周血成熟B細胞水平與血清免疫球蛋白水平是評價疾病嚴重程度的重要指標之一。有研究發(fā)現(xiàn)，能引起蛋白結構嚴重改變的突變類型如無義突變、插入突變或缺失突變的XLA患兒常規(guī)免疫功能水平并無明顯低下[18]。本研究錯義突變XLA患兒血清IgG水平與其他突變類型無顯著差異。但結合國內外其他大樣本及本研究結果提示，錯義突變者的臨床改變較輕，血清IgG水平相對較高。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，真核生物甲基化位點，CpG位點是BTK基因序列中較易發(fā)生突變的位點。在BTK整個編碼序列中共有18個CpG位點，而其中僅有8個位點(13,28,255,288,520,525,562和641)有突變報道[12]。本研究中有8例XLA患兒突變位于CpG位點，1例突變位于PH區(qū)的編碼第28位氨基酸的CpG位點。從BTK蛋白結構來看，位于PH區(qū)的第28位精氨酸是重要的磷脂酰肌醇結合位點，也是BTK蛋白介導信號轉導途徑中重要的結構位點，因此該位點突變無論何種突變類型均會造成蛋白結構改變，導致蛋白功能障礙[19]。但也有研究指出，位于該位點的錯義突變(R28C)并不會造成患者出現(xiàn)嚴重的臨床表現(xiàn)，且仍保留部分正常的BTK蛋白表達[20]。本研究例3的血清IgG水平和外周血B細胞數(shù)量均高于其他患兒，且臨床表現(xiàn)相對較輕。另2例錯義突變位于TK區(qū)的第525位精氨酸(CpG)位點，該位點無論是錯義突變或無義突變均可能導致明顯的疾病臨床表現(xiàn)[21]，其中例22臨床表現(xiàn)較特殊，除反復呼吸道感染外還伴有顏面部的毛細血管擴張，是否與CpG位點突變類型有關尚不清楚；例2突變位于PH區(qū)的編碼第13位氨基酸的CpG位點，這一位點的無義突變亦可造成蛋白結構的改變導致蛋白的功能障礙。

位于PH結構域上的L11至T33包含眾多的保守序列，氨基酸F10-X-K12-S14-X10-F25-K26-X-R28-X-F30-X-L32-X4-L37-X-Y39構成PH結構域中重要的3-磷酸肌醇結合位點，其中F10、L31、Y39、F102、V113 和I125是高度保守的氨基酸殘基，這些位點突變直接影響B(tài)TK蛋白的功能，可出現(xiàn)較為典型的XLA臨床表現(xiàn)[13]。本研究中3例基因突變位于該區(qū)域，其中例1和3為錯義突變(L11P和R28C)，例2為無義突變(R13X)，且血清IgG水平均高于2 g·L-1，例3 BTK蛋白表達水平明顯高于例1。研究表明，位于PH結構域的突變均能造成該結構與磷酸肌醇結合的親和力下降,而某些位點如R28的突變則仍保留較高的與磷酸肌醇結合的親和力，因而所造成的臨床表現(xiàn)也較輕[13，20]。本研究中有8例基因突變位于SH3和SH2結構域，其中有2例為錯義突變(H333Y和I355N)，為BTK基因突變數(shù)據(jù)庫中尚未報道的突變類型。值得注意的是，錯義突變可以發(fā)生于BTK基因除了TH結構域中的脯氨酸富集區(qū)及整個SH3區(qū)的各個結構域[18,22]。這可能與SH3結構域在BTK蛋白功能中的負調控功能有關。本研究3例位于SH3結構域的突變均為無義突變。

研究表明，SH3和SH2結構域與TK區(qū)和PH區(qū)相互作用，某些錯義突變可能只改變蛋白的功能而不影響蛋白的空間結構[18]。本研究例17位于SH2結構域的錯義突變(I355N)，可檢測到正常的BTK蛋白表達。研究表明，SH2結構域中的R288和V319是BTK蛋白中重要的保守位點，這些位點發(fā)生的突變可能干擾BTK蛋白與配體的結合[18]。本研究例19位于V319的插入突變，其外周血B細胞缺如，血清IgG<1 g·L-1,有較為典型的臨床表現(xiàn)，且伴有嚴重的關節(jié)炎。

XLA患兒單核細胞BTK蛋白的表達水平也是反映疾病嚴重程度的指標之一。本研究中所使用的48-2H是針對BTK基因的SH3功能區(qū)，對其他功能區(qū)發(fā)生的突變也可檢測到BTK的表達異常，但可能存在BTK蛋白表達程度差異[23]。本研究7/13例(53.8%)BTK蛋白表達明顯降低，以引起B(yǎng)TK蛋白結構明顯改變的無義突變、插入突變及缺失突變?yōu)橹?，而BTK蛋白表達正?；純阂藻e義突變?yōu)橹?。提示，不同的基因突變類型與BTK蛋白表達水平密切相關故而影響疾病的表型，但未檢測到BTK蛋白表達水平降低并不能排除BTK基因突變的存在。本研究結果顯示，單核細胞BTK蛋白表達的多少與外周血B細胞的數(shù)量以及血清IgG水平無顯著相關，這與文獻報道較為一致，具體原因還不清楚，可能是基因型與表型間還存在多種其他因素的影響[6,7,10,22]。

XLA患者家系中女性攜帶者的判定對于優(yōu)生有重要的意義。本研究對32例患兒母親及部分家族親屬進行了基因分析，其中28例母親攜帶有突變的BTK基因，4例患兒母親基因分析正常，其基因突變可能是卵母細胞新發(fā)生的突變[8]或生殖腺嵌合型所致。Parolini等[24]報道首例XLA患兒母親為生殖腺嵌合型。本研究提示攜帶BTK基因突變女性親屬可能將所攜帶的突變基因遺傳給下一代，且XLA患兒母親再次分娩帶有突變基因XLA患兒的風險較高。

XLA的合并癥與BTK基因間的關系尚不清楚。XLA中最重要的一類合并癥是關節(jié)炎并可致殘。本組患兒關節(jié)炎的發(fā)生率為22.5%(9/40例)。進一步分析顯示，21例第18號外顯子2031位堿基存在C/T多態(tài)性XLA患兒關節(jié)炎的發(fā)生率為28.6%(6/21例)，高于無多態(tài)性患兒(15.8%，3/19例)，這是否提示多態(tài)性的存在可能增加發(fā)生關節(jié)炎風險還有待進一步研究。

目前，雖然尚無有力的證據(jù)證實XLA患兒基因型與表型之間存在明確關系，但通過本研究并結合國外較大樣本的分析可見，僅引起單個氨基酸替代改變的錯義突變可能與較大的診斷年齡、較高的外周血B細胞數(shù)量和血清IgG水平以及與正常的BTK蛋白表達水平有關。本研究中21例XLA患兒存在BTK基因多態(tài)性(2031C/T)，這種多態(tài)性可能增加合并關節(jié)炎的風險。

注：本文部分基因突變數(shù)據(jù)發(fā)表于J Clin Immunol,2009,29(3):352-356

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