久效磷對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）脅迫相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響＊

田 雨，汝少國

（中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003）

久效磷對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）脅迫相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響＊

田 雨，汝少國＊＊

（中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島266003）

研究了久效磷（Monocrotophos，MCP）對秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）脅迫相關(guān)基因m RNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明久效磷暴露能夠?qū)е耯sp－16.41、hsp－70、cyp－35a2、vit－2、vit－6和age－1基因表達(dá)量顯著升高，cep－1、ape－1、sod－1、sod－3、ctl－2、ctl－3、gst－1、daf－12和daf－21基因表達(dá)量顯著降低，對hsp－16.2、mtl－1和mtl－2基因表達(dá)量無顯著影響。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，久效磷主要影響hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1基因表達(dá)，這些基因可作為久效磷毒性效應(yīng)的敏感分子生物標(biāo)志物。

久效磷（MCP）；秀麗隱桿線蟲；脅迫相關(guān)基因；mRNA表達(dá)

久效磷（Monocrotophos，MCP）是1種廣譜類內(nèi)吸附性有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticide，OPs），其殘留造成了嚴(yán)重的土壤和水體污染［1－2］。研究表明，久效磷能夠?qū)Ψ前猩锂a(chǎn)生多種毒性作用。久效磷能夠產(chǎn)生細(xì)胞毒性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞特征性酶活力，如超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Gultathione S transferases，GST）等［3－5］。邴欣和田華等［6－7］先后研究證明久效磷對雄性魚類具有環(huán)境雌激素效應(yīng)。王擺等［8］報道久效磷能夠影響細(xì)小色矛線蟲（Chromadorina germanica）胚胎發(fā)育和繁殖。此外，久效磷還具有生殖毒性、神經(jīng)毒性和遺傳毒性等［9－11］。

當(dāng)生物體受到環(huán)境變化或外源污染物脅迫時，其個體生理水平會隨之發(fā)生響應(yīng)，如生殖、發(fā)育、行為等受到抑制，而這種響應(yīng)是生物體分子水平響應(yīng)的表觀體現(xiàn)。與個體生理水平響應(yīng)相比，分子水平響應(yīng)的敏感性和特異性更高，因此分子水平上的基因表達(dá)變化被認(rèn)為是一種用于污染物早期檢測的良好手段［12］。在常用的脅迫相關(guān)基因中，熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）基因可以表征高溫等環(huán)境影響和外源污染物的毒性效應(yīng)包括環(huán)境雌激素效應(yīng)［13］，卵黃原蛋白（Vitellogenin，VTG）基因可以表征外源污染物的環(huán)境雌激素效應(yīng)［14］，CYP450、SOD、CAT和GST基因可以表征外源污染物引起的氧化脅迫等細(xì)胞毒性［3，5，15］，而金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）基因則可以表征重金屬物質(zhì)的毒性作用［16］，這些基因?yàn)樵u價和檢測外源污染物提供了理想的分子生物標(biāo)志物。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）是第1個基因組被完全測序的多細(xì)胞動物，且與脊椎動物基因組相比高度保守，是分子生物學(xué)研究中的理想模式生物。同時，由于秀麗隱桿線蟲對多種脅迫響應(yīng)敏感，已被廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究。因此，本文選擇秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)動物，通過實(shí)時定量PCR研究久效磷對秀麗隱桿線蟲多種脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響，并通過主成分分析探討受久效磷影響的主要基因，從而確定久效磷毒性效應(yīng)的敏感分子生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 試劑

久效磷農(nóng)藥（O，O－二甲基－2－甲基氨基甲?；?－甲基乙烯基磷酸酯，40%水溶性制劑）購自青島農(nóng)藥廠，商標(biāo)濃度為40%，利用氣相色譜法測得的實(shí)際濃度為（40±0.1）%［17］。其余試劑均購自Sigma－Aldrich公司。

1.2 線蟲品系及培養(yǎng)

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）品系為野生型N2，由國際線蟲遺傳中心（CGC）（Minneapolis，MN，USA）贈送，用瓊脂培養(yǎng)基（NGM）（3 g·L－1NaCl，2.5 g·L－1蛋白胨，5 mg·L－1膽固醇，1 mmol·L－1CaCl2，1 mmol·L－1MgSO4，25 mmol·L－1磷酸氫鉀緩沖液，p H＝6.0，17 g·L－1瓊脂）在（20±1）℃條件下恒溫培養(yǎng)，喂食大腸桿菌OP50［18］。

1.3 L4期幼蟲同步化處理

將懷卵成蟲用雙蒸水沖洗至15 m L離心管中，用漂白混合液（5 mol·L－1NaOH，5%NaClO）振蕩處理10 min，1 300×g離心30 s。隨后用雙蒸水沖洗后1 300×g離心30 s。收集卵并置于NGM培養(yǎng)基，喂食大腸桿菌OP50，20±1℃培養(yǎng)48 h，獲得同步化的L4期幼蟲［19］。然后用雙蒸水將L4期幼蟲沖洗至15 m L離心管，1 000×g離心1 min去上清液，再用K－medium（0.032 mol·L－1KCl，0.051 mol·L－1NaCl）［20］沖洗3次后用于暴露實(shí)驗(yàn)。

1.4 急性毒性實(shí)驗(yàn)

在24孔板中用K－medium配制久效磷終濃度為864、720、600、500、416、347和289 mg·L－1的1 m L處理液，并設(shè)K－medium空白對照組，每組設(shè)3個平行樣。每孔放入10±1條同步化處理后的線蟲，（20±1）℃暴露24 h。在體視顯微鏡下觀察并記錄存活和死亡線蟲數(shù)目，計算線蟲存活率。用接種針觸碰線蟲無反應(yīng)即為死亡。

1.5 亞致死濃度暴露實(shí)驗(yàn)

暴露實(shí)驗(yàn)采用直徑6 cm滅菌培養(yǎng)皿，每皿加入10 m L久效磷終濃度為0.5、5.0和50.0 mg·L－1的K－medium，久效磷濃度是根據(jù)MCP 24－h(huán) LC50（494 mg·L－1）的1／1 000、1／100和1／10設(shè)置的，每皿接種同步化處理后的L4期幼蟲100條［21］，暴露時間24 h，暴露條件為（20±1）℃且不添加食物。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR

亞致死濃度暴露實(shí)驗(yàn)后，收集Young adults線蟲，經(jīng)M9緩沖液（6 g·L－1Na2HPO4，3 g·L－1KH2－PO4，5 g·L－1NaCl，1 mol·L－1MgSO4）和雙蒸水沖洗后，用于RNA提取?？俁NA提取采用E.Z.N.A.TMMicroEluteTMTotal RNA Kit（Omega Bio－Tek，Inc.，Norcross，GA，USA）。RNA質(zhì)量根據(jù)260和280 nm吸光度比值確定。根據(jù)260 nm吸光度確定RNA濃度后，用DNase I（Promega CO.，Madison，WI，USA）進(jìn)行DNA消化處理。反轉(zhuǎn)錄PCR采用First Strand cDNA Synthesis Kit－Rever Tra Aceα－TM（TOYOBO CO.，Osaka，Japan）和Bio－Rad MycyclerTMThermal Cycler（Bio－Rad，Hercules，CA，USA）。根據(jù)C.elegans數(shù)據(jù)庫（www.wormbase.org）設(shè)計引物（見表1），其中act－1和rpa－1為內(nèi)參基因。實(shí)時熒光定量PCR在Eppendorf Mastercycler?ep realplex2（Eppendorf AG，Barkhausenweg，Hamburg，Germany）中運(yùn)行，20μL real－time PCR反應(yīng)體系中含有10μL Platinum?SYBR?Green qPCR Super Mix－UDG，0.4μL 10 mmol·L－1正反向引物，0.4 μL ROX參考染料（Invitrogen CO.，Carlsbad，California，USA）和0.8μL第一鏈cDNA（模板），反應(yīng)程序95℃30 s；95℃5 s，61℃30 s，40 cycles；融解曲線為95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，從61～95℃每上升0.5℃取一次熒光值。采用參照基因的△C t法（2ΔCt）計算目的基因表達(dá)值，其中ΔC t＝［C t（act－1）＋C t（rpa－1）］／2－C t（目的基因），并進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。

表1 Real－time PCR引物序列Table 1 Primers for real－time PCR amplification

續(xù)表1

1.7 數(shù)據(jù)處理

LC50通過概率分析法獲得。其他數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示并用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析（one－way ANOVA）進(jìn)行對照組和處理組比較，0.01＜P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。對具有顯著性差異的基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），取特征根數(shù)值為1，迭代次數(shù)為200。

2 結(jié)果

2.1 久效磷對秀麗隱桿線蟲脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響

久效磷暴露對秀麗隱桿線蟲脅迫相關(guān)基因表達(dá)量影響見圖1。

圖1 久效磷對秀麗隱桿線蟲脅迫相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of MCP on the expression of stress－related genes of C.elegans

經(jīng)久效磷暴露后，與對照組相比，環(huán)境雌激素效應(yīng)相關(guān)基因hsp－16.41表達(dá)量隨久效磷濃度升高而極顯著升高（P＜0.01），hsp－70表達(dá)量在50 mg·L－1久效磷暴露組顯著升高（0.01＜P＜0.05），vit－2表達(dá)量在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露組極顯著升高（P＜0.01），vit－6表達(dá)量在0.5 mg·L－1久效磷暴露組極顯著降低（P＜0.01），而在50 mg·L－1久效磷暴露組極顯著升高（P＜0.01），hsp－16.2表達(dá)量在各久效磷暴露組均無顯著性變化。

經(jīng)久效磷暴露后，與對照組相比，細(xì)胞毒性相關(guān)基因cyp－35a2表達(dá)量在50 mg·L－1久效磷暴露組極顯著升高（P＜0.01），sod－1和ctl－2表達(dá)量在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露組極顯著降低（P＜0.01），sod－3表達(dá)量在50 mg·L－1久效磷暴露組極顯著降低（P＜0.01），ctl－3表達(dá)量在0.5 mg·L－1久效磷暴露組極顯著降低（P＜0.01），gst－1表達(dá)量隨久效磷濃度升高而極顯著降低（P＜0.01）。

經(jīng)久效磷暴露后，與對照組相比，發(fā)育相關(guān)基因daf－12和daf－21表達(dá)量在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露組均極顯著降低（P＜0.01），age－1表達(dá)量在5.0 mg·L－1久效磷暴露組極顯著升高（P＜0.01），ape－1表達(dá)量在0.5 mg·L－1久效磷暴露組極顯著升高（P＜0.01），而在5.0和50 mg·L－1久效磷暴露組均極顯著降低（P＜0.01），cep－1表達(dá)量在各久效磷暴露組均極顯著降低（P＜0.01）。

經(jīng)久效磷暴露后，與對照組相比，金屬脅迫相關(guān)基因mtl－1和mtl－2表達(dá)量在各久效磷暴露組均無顯著性變化。

2.2 久效磷對秀麗隱桿線蟲脅迫相關(guān)基因表達(dá)影響的主成分分析

對基因表達(dá)存在顯著差異的15個脅迫相關(guān)基因進(jìn)行主成分分析，數(shù)據(jù)矩陣的特征值、各特征值的百分率和累計貢獻(xiàn)率見表2。各特征值相應(yīng)的特征向量就是久效磷對不同脅迫相關(guān)基因表達(dá)影響的權(quán)重系數(shù)，選擇特征值＞1的前幾個主成分作為從不同方面表征久效磷m RNA水平上的主要毒性效應(yīng)。從表2可以看出，特征值＞1的3個主成分的累計貢獻(xiàn)率已達(dá)到100%，說明3個主成分就能夠完全反映久效磷m RNA水平上的主要毒性效應(yīng)。

表2 樣本相關(guān)矩陣的特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率Table 2 The eigenvalues，contribution and cumulative contribution of matrix

主成分負(fù)荷情況見表3。從表3可以看出，第一主成分的特征值為10.87，貢獻(xiàn)率為72.44%，其特征向量中載荷較高的是ctl－2（0.986）和hsp－70（－0.968），主要表征久效磷的細(xì)胞毒性和環(huán)境雌激素效應(yīng)。第二主成分的特征值為2.87，貢獻(xiàn)率為19.12%，其特征向量中載荷較高的是ctl－3（0.901）和cep－1（0.732），主要表征久效磷的細(xì)胞毒性和發(fā)育毒性。第三主成分的特征值為1.27，貢獻(xiàn)率為8.43%，其特征向量中載荷較高的是vit－2（0.584）和age－1（0.548），主要表征久效磷的環(huán)境雌激素效應(yīng)和神經(jīng)毒性。

表3 主成分負(fù)荷表Table 3 Component matrix

3 討論

基因表達(dá)指標(biāo)不僅在評價外源化合物作用中敏感、有效，還可以根據(jù)目標(biāo)基因的特性確定外源化合物某些特定類型的毒性作用。本文以秀麗隱桿線蟲為實(shí)驗(yàn)動物研究了久效磷對多種脅迫相關(guān)基因表達(dá)的影響。

HSP和VTG是雌激素脅迫相關(guān)蛋白，在具有雌激素活性物質(zhì)作用下其表達(dá)會明顯升高。Lu等［13］報道17－β－雌二醇能夠造成hsp－25／27和hsp－70蛋白表達(dá)增加。Tian等［14］報道久效磷能夠引起雄性金魚VTG mRNA表達(dá)升高并誘導(dǎo)產(chǎn)生VTG，表現(xiàn)出雌激素活性。本文中，秀麗隱桿線蟲的hsp－16.41、hsp－70、vit－2和vit－6在久效磷暴露下mRNA表達(dá)量均顯著升高，與其他學(xué)者研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步證明了久效磷具有環(huán)境雌激素效應(yīng)。

通常情況下，生物體內(nèi)都存在一套解毒系統(tǒng)以抵抗外界環(huán)境變化和外源化合物脅迫。秀麗隱桿線蟲與其他脊椎動物類似，也是主要通過多種解毒酶來完成解毒過程。SOD是生物體內(nèi)抵抗氧化脅迫的重要活性物質(zhì)，能夠通過清除氧自由基維持生物體處于正常狀態(tài)。過氧化氫作為代謝廢物能夠?qū)ι矬w造成損害，而CAT能夠通過催化過氧化氫分解保持機(jī)體健康。GST可以催化谷胱甘肽與各種親電子外源化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，從而避免外源化學(xué)物質(zhì)在生物轉(zhuǎn)化中形成某些生物活性中間產(chǎn)物與細(xì)胞生物大分子重要成分共價結(jié)合對機(jī)體造成損害，起到解毒作用。研究表明這些解毒酶活性在久效磷作用下都會受到抑制作用。唐學(xué)璽等［22］和白潔等［23］分別發(fā)現(xiàn)久效磷能夠?qū)е略孱惡蛯ξrSOD活性降低，Kavitha和Rao［5］發(fā)現(xiàn)久效磷導(dǎo)致魚類SOD和CAT活性均降低，Siddiqui等［24］報道久效磷能夠抑制大鼠GST活性。本文中sod－1、sod－3、ctl－2、ctl－3、gst－1在久效磷暴露下表達(dá)量均降低，在mRNA水平上驗(yàn)證了久效磷對SOD、CAT和GST活性的抑制作用，表明久效磷能夠擾亂解毒過程產(chǎn)生細(xì)胞毒性。然而，與其他解毒酶相比，CYP450結(jié)果卻截然相反，cyp－35a2表達(dá)量顯著升高。大量研究結(jié)果表明生物體受到外源化學(xué)物質(zhì)脅迫后，會通過提高細(xì)胞色素P450酶基因表達(dá)進(jìn)而催化外源化學(xué)物質(zhì)的活化代謝，以緩解毒性［15，25－26］。同時，本文認(rèn)為這種解毒能力的增強(qiáng)使得秀麗隱桿線蟲擁有了有效的防御系統(tǒng)以抵抗久效磷引起的損傷。

秀麗隱桿線蟲發(fā)育過程中包括一個可選擇的dauer期，當(dāng)L1期和L2期秀麗隱桿線蟲在不適環(huán)境條件下就會進(jìn)入dauer期，而控制這一過程的就是daf基因［27］。作為2種類型的daf基因，daf－12編碼一種調(diào)節(jié)dauer形成的類固醇激素受體［28］，而daf－21編碼一種hsp90家族的分子伴侶，daf－21活性是幼蟲發(fā)育過程中所必需的［29］。久效磷造成daf－12和daf－21表達(dá)降低表明久效磷作為一種環(huán)境脅迫因子能夠影響秀麗隱桿線蟲dauer形成并影響其發(fā)育過程，產(chǎn)生發(fā)育毒性。除daf基因外，age－1也與dauer幼蟲形成有關(guān)。age－1是胰島素樣信號途徑組成成分之一，而胰島素樣信號途徑除與dauer幼蟲形成有關(guān)，同時age－1途徑還與調(diào)節(jié)生命周期［30］和化學(xué)趨向性密切相關(guān)［31］。而實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明久效磷能夠?qū)е滦沱愲[桿線蟲化學(xué)趨向性缺陷，結(jié)合age－1基因表達(dá)量升高的結(jié)果進(jìn)一步說明了久效磷可能通過作用于age－1途徑而產(chǎn)生化學(xué)趨向性缺陷，表現(xiàn)出一定的神經(jīng)毒性。本文推測age－1基因表達(dá)量的升高可能有2種原因：一是由于久效磷導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲化學(xué)趨向性缺陷后，age－1通過提高表達(dá)水平啟動age－1途徑補(bǔ)救機(jī)制而造成的；二是可能與氧化脅迫有關(guān)，Barsyte等［30］報道氧化脅迫能夠加速細(xì)胞衰老，而age－1是細(xì)胞衰老速率的重要調(diào)節(jié)因子，由于久效磷能夠產(chǎn)生氧化脅迫能力，就可能通過增加age－1基因表達(dá)量來加速細(xì)胞衰老。細(xì)胞衰老到最后就表現(xiàn)細(xì)胞凋亡，兩者也都是發(fā)育過程中的必經(jīng)階段。cep－1編碼人腫瘤抑制基因p53的直系同源基因，是DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡過程中所必需的；ape－1是cep－1的保守抑制因子，在缺失的情況下能夠?qū)е耤ep－1控制的細(xì)胞凋亡增加［32］。而對于久效磷造成的cep－1和ape－1表達(dá)量同時降低原因還不清楚，需要在今后的工作中進(jìn)一步研究。

以上研究結(jié)果表明，久效磷能夠?qū)е露喾N脅迫相關(guān)基因表達(dá)量顯著變化，而這些基因表達(dá)量的變化可以表征久效磷的多種毒性作用。hsp－16.41、hsp－70、vit－2和vit－6基因表達(dá)量的變化可以表征久效磷的環(huán)境雌激素效應(yīng)，cyp－35a2、sod－1、sod－3、ctl－2、ctl－3和gst－1基因表達(dá)量的變化可以表征久效磷的細(xì)胞毒性，cep－1、ape－1、daf－12和daf－21基因表達(dá)量的變化可以表征久效磷的發(fā)育毒性，age－1基因表達(dá)量的變化可以表征久效磷的神經(jīng)毒性。其中，cyp－35a2和vit－2表達(dá)量受久效磷影響變化最大，表明細(xì)胞毒性和環(huán)境雌激素效應(yīng)可能是久效磷的主要毒性作用。為驗(yàn)證這一推測，本文通過主成分分析，從多個變量的線性變換篩選出少數(shù)重要變量，確定受久效磷影響的主要基因。本文通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1在主成分的特征向量中載荷較高，其中第一主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)到了72.44%，而ctl－2和hsp－70在第一主成分中載荷較高，表明久效磷主要影響hsp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1基因表達(dá)，尤其是ctl－2和hsp－70基因表達(dá)。這些主要受影響基因表達(dá)量的變化表征了久效磷的細(xì)胞毒性、環(huán)境雌激素效應(yīng)、發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性。

大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明久效磷的主要毒性作用集中于上述幾種毒性作用。邴欣等［4］報道久效磷能夠通過損傷真鯛（Pagrosmus major）鰓、肝、腎細(xì)胞內(nèi)主要細(xì)胞器產(chǎn)生細(xì)胞毒性。邴欣等［6］報道0.01、0.1和1.0 mg·L－1久效磷均能誘導(dǎo)雄性金魚分泌卵黃原蛋白，并且能夠明顯抑制金魚精巢γ－谷胺酰轉(zhuǎn)移酶（γ－GTP）活性，造成金魚精巢支持細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜和線粒體嵴部分溶解，以及脂滴增加，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)髓磷脂象，表明久效磷可能具有環(huán)境雌激素活性。王擺［33］報道久效磷能夠嚴(yán)重抑制細(xì)小色矛線蟲（Chromadorina germanica）胚胎發(fā)育和繁殖，具有發(fā)育和生殖毒性。房燕［34］報道久效磷能夠損傷金魚（Carassius auratus）精巢支持細(xì)胞、leydig氏細(xì)胞及精子線粒體結(jié)構(gòu)，并影響SOD等多種特征性酶活性，同時久效磷還能降低精子運(yùn)動力，損傷精子DNA，最終影響生殖和發(fā)育。Rajinia等［35］報道低濃度久效磷在嚴(yán)重抑制秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，ACh E）活性的同時，也造成了秀麗隱桿線蟲平均運(yùn)動速率的下降，表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)毒性。姚丹［36］報道久效磷不僅通過膽堿能系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，還能通過擾亂馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）多巴胺和血清素等非膽堿能系統(tǒng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性。隨著研究的深入，逐漸證實(shí)久效磷具有環(huán)境雌激素效應(yīng)。姜雪［37］報道久效磷在發(fā)揮其環(huán)境雌激素效應(yīng)過程中，能夠通過調(diào)節(jié)性激素水平干擾GH／IGF－I軸從而抑制金魚（Carassius auratus）生長產(chǎn)生發(fā)育毒性。田華［7］從性腺性激素合成與轉(zhuǎn)化、垂體促性腺激素（Gonadotropins，Gt Hs）合成與分泌、下丘腦促性腺激素釋放激素（Gonadotropin－releasing hormones，Gn RHs）調(diào)控3個層次，研究了久效磷對雄性、雌性金魚（Carassius auratus）下丘腦－垂體－性腺軸的干擾作用，探討了久效磷環(huán)境雌激素作用機(jī)制，并認(rèn)為久效磷能夠通過干擾生殖軸線產(chǎn)生生殖毒性。

綜上，統(tǒng)計學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證了本文對于久效磷主要毒性作用的推測，而表征久效磷主要毒性作用的相關(guān)基因則可以作為久效磷的敏感分子生物標(biāo)志物，用于環(huán)境檢測和毒性評價。

4 結(jié)語

本文研究了久效磷對秀麗隱桿線脅迫相關(guān)基因m RNA表達(dá)的影響，從m RNA水平上表征了久效磷的細(xì)胞毒性、環(huán)境雌激素效應(yīng)、發(fā)育毒性和神經(jīng)毒性，并通過主成分分析確定了受久效磷影響的主要基因?yàn)閔sp－70、ctl－2、ctl－3、vit－2、cep－1和age－1，這些基因可以作為久效磷的敏感分子生物標(biāo)志物，用于環(huán)境檢測和毒性評價。

［1］ 譚和平，陳能武，黃蘋，等.四川茶園土壤中農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀分析［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25（增刊）：58－60.

［2］ 康躍惠，張干，盛國英，等.固相萃取法測定水源地中的有機(jī)磷農(nóng)藥［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2000，20（1）：1－4.

［3］ Siddiqui M K J，Mahbooba M，Mustafa M.Interaction of monocrotophos and its novel thion analogues with microsomal cytochrome P－450：in vivo and in vitro studies in rat［J］.Toxicology，1992，76（2）：133－139.

［4］ 邴欣，汝少國，姜明，等.久效磷對真鯛鰓、肝和腎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.海洋科學(xué)，2002，26（9）：42－45.

［5］ Kavitha P，Rao J V.Oxidative stress and locomotor behaviour response as biomarkers for assessing recovery status of mosquito fish，Gambusia affinis after lethal effect of an organophosphate pesticide，monocrotophos［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，87：182－188.

［6］ 邴欣，汝少國，姜明.久效磷對金魚的環(huán)境雌激素效應(yīng)的研究［J］.高技術(shù)通訊，2006，16（11）：1195－1199.

［7］ 田華.久效磷農(nóng)藥對金魚（Carassius auratus）生殖軸線的影響研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2010.

［8］ 王擺，汝少國，王蔚.久效磷對細(xì)小色矛線蟲胚胎發(fā)育和繁殖的影響［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2009，29（5）：543－547.

［9］ 房燕，汝少國，邴欣，等.久效磷對金魚精巢超顯微結(jié)構(gòu)和特征性酶活性的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2007，31（5）：568－574.

［10］ Yao D，Ru S，Katow H.The neurotoxic effects of monocrotophos on the formation of the serotonergic nervous system and swimming activity in the larvae of the sea urchin Hemicentrotus pulcherrimus［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2010，30：181－187.

［11］ Yaduvanshi S K，Ojha A，Pant S C，et al.Monocrotophos induced lipid peroxidation and oxidative DNA damage in rat tissues［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2010，97（3）：214－222.

［12］ Menzel R，Rodel M，Kulas J，et al.CYP35：Xenobiotically induced gene expression in the nematode Caenorhabditis elegans［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2005，438：93－102.

［13］ Lu A，Ran R，Clark J，et al.17－β－Estradiol induces heat shock proteins in brain arteries and potentiates ischemic heat shock protein induction in glia and neurons［J］.Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism，2002，22：183－195.

［14］ Tian H，Ru S，Wang Z，et al.Estrogenic effects of monocrotophos evaluated by vitellogenin mRNA and protein induction in male goldfish（Carassius auratus）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology.Part C，2009，150：231－236.

［15］ Roh J Y，Lee J，Choi J.Assessment of stress－related geneexpression in the heavy metal－exposed nematode Caenorhabditis elegans：A potential biomarker for metal－induced toxicity monitoringand environmental risk assessment［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，2006，25：2946－2956.

［16］ Klaassen C D，Liu J，Diwan B A.Metallothionein protection of cadmium toxicity［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2009，238（3）：215－220.

［17］ Ru S，Wei X，Jiang M，et al.In vivo and in vitro inhibitions of red drum（Sciaenops ocellatus）brain acetylcholinesterase and liver carboxylesterase by monocrotophos at sublethal concentrations［J］.Water，Air，and Soil Pollution，2003，149：17－25.

［18］ Brenner S.The genetics of Caenorhabditis elegans［J］.Genetics，1974，77：71－94.

［19］ Donkin S，Williams P L.Influence of developmental stage，salts，and food presence on various end points using Caenorhabditis elegans for aquatic toxicity testing［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，1995，14：2139－2147.

［20］ Williams P L，Dusenbery D B.Aquatic toxicity testing using the nematode Caenorhabditis elegans［J］.Environmental Toxicology and Chemistry，1990，9：1285－1290.

［21］ Ura K，Kai T，Sakata S，et al.Aquatic acute toxicity testing using the nematode Caenorhabditis elegans［J］.Journal of Health Science，2002，48：583－586.

［22］ 唐學(xué)璽，顏挺進(jìn)，李永祺.久效磷對扁藻的損傷作用Ⅰ：扁藻細(xì)胞的活性氧傷害作用［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，1998，9（6）：627－630.

［23］ 白潔，李巋然，唐學(xué)璽，等.久效磷對中國對蝦體內(nèi)SOD活力影響的初步研究［J］.海洋通報，1998，17（4）：41－45.

［24］ Siddiqui M K J，Mahboob M，Mustafa M.Hepatic and extra hepatic glutathione depletion and glutathione－S－transferase inhibi－tion by monocrotophos and its two thiol analogues［J］.Toxicology，1990，64（3）：271－279.

［25］ Menzel R，Bogaert T，Achazi R A.Systematic gene expression screen of Caenorhabditis elegans cytochrome P450 genes reveals CYP35 as strongly xenobiotic inducible［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，395（2）：158－168.

［26］ Roh J Y，Park Y K，Park K，et al.Ecotoxicological investigation of CeO2and TiO2nanoparticles on the soil nematode Caenorhabditis elegans using gene expression，growth，fertility，and survival as endpoints［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2010，29：167－172.

［27］ Riddle D L，Albert P S.Genetic and environmental regulation of dauer larva development in C.elegans II［M］.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1997.

［28］ Antebi A，Culotti J G，Hedgecock E M.Daf－12 regulates developmental age and the dauer alternative in Caenorhabditis elegans［J］.Development，1998，125：1191－1205.

［29］ Inoue T，Hirata K，Kuwana Y，et al.Cell cycle control by daf－21／Hsp90 at the first meiotic prophase／metaphase boundary during oogenesis in Caenorhabditis elegans［J］.Development，Growth and Differentiation，2006，48：25－32.

［30］ Barsyte D，Lovejoy D A，Lithgow G J.Longevity and heavy metal resistance in daf－2 and age－1 long－lived mutants of Cae－norhabditis elegans［J］.The FASEB Journal，2001，15：627－634.

［31］ Tomioka M，Adachi T，Suzuki H，et al.The insulin／pi 3－kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans［J］.Neuron，2006，51：613－625.

［32］ O'Neil N，Rose A.DNA repair，WormBook，ed.The C.elegans Research Community，WormBook［EB／OL］.doi／10.1895／wormbook.1.54.1.（2006－01－01）.http：／／www.wormbook.org.

［33］ 王擺.以海洋線蟲Chromadorina sp.為模型動物的環(huán)境激素活體篩選的初步研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2006.

［34］ 房燕.久效磷對雄性金魚的生殖毒性研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2007.

［35］ Rajini P S，Melstrom P，Williams P L.A comparative study on the relationship between various toxicological endpoints in Caenorhabditis elegans exposed to organophosphorus insecticides［J］.Journal of Toxicology and Environmental Health Part A，2008，71（15）：1043－1050.

［36］ 姚丹.久效磷對馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）胚胎發(fā)育神經(jīng)毒性效應(yīng)研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2010.

［37］ 姜雪.久效磷對早期生長發(fā)育階段斑馬魚（Danio rerio）GH／IGF－I軸的影響［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2009.

Effects of Monocrotophos on the mRNA Expression of Stress－Related Genes of Caenorhabditis elegans

TIAN Yu，RU Shao－Guo
（College of Marine Life Science，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Effects of monocrotophos（MCP）on the m RNA expression of stress－related genes of Caenorhabditis elegans were investigated in this research.Treatment with MCP resulted in significant increases of hsp－16.41，hsp－70，cyp－35a2，vit－2，vit－6 and age－1 m RNA expressions，significant decreases of cep－1，ape－1，sod－1，sod－3，ctl－2，ctl－3，gst－1，daf－12 and daf－21 mRNA expressions，and indistinctive changes of hsp－16.2，mtl－1 and mtl－2 mRNA expressions.Principal component analysis indicated that MCP mainly influences mRNA expressions of hsp－70，ctl－2，ctl－3，vit－2，cep－1 and age－1 genes，which therefore could serve as sensitive molecular biomarkers for the toxicity of MCP.

monocrotophos（MCP）；Caenorhabditis elegans；stress－related genes；mRNA expression

X171

A

1672－5174（2012）03－050－07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30671618）資助

2011－04－18；

2011－08－29

田 雨（1983－），男，博士生。E－mail：rainchildren＠163.com

＊＊通訊作者：E－mail：rusg＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象