Bmi-1在結(jié)直腸癌卵巢轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)及意義

李景文 王錫山

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。在我國發(fā)病率很高，40%～50%接受結(jié)直腸癌切除的患者死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1]。常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官為肝臟，其次為肺、骨、腦，而卵巢轉(zhuǎn)移相對(duì)較少見，同時(shí)性卵巢轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生率為3.6%～7.4%，異時(shí)性卵巢轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生率約1.5%[2]。雖然卵巢轉(zhuǎn)移癌的發(fā)生率較低，但一旦發(fā)生卵巢轉(zhuǎn)移就意味著晚期，疾病進(jìn)展較快，預(yù)后較差，所以了解腸源性卵巢轉(zhuǎn)移癌的分子機(jī)制至關(guān)重要。

B細(xì)胞特異單克隆白血病毒整合位點(diǎn)1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)，Bmi-1是首個(gè)被報(bào)道與癌癥生長(zhǎng)有關(guān)的PcG基因。Bmi-1作為原癌基因與c-myc共同作用，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成，并直接參與干細(xì)胞的自我更新[3]。近年來在胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌以及部分血液系統(tǒng)惡性疾病中均發(fā)現(xiàn)Bmi-1的異常表達(dá)[4-9]，而關(guān)于腸源性卵巢轉(zhuǎn)移癌的報(bào)道甚少。本研究通過免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)Bmi-1蛋白在正常腸黏膜、結(jié)直腸癌、腸源性卵巢轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)，探討B(tài)mi-1與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系、臨床意義及其在卵巢轉(zhuǎn)移過程中的作用。

材料與方法

一、標(biāo)本和臨床資料

從2010年4月到2011年7月收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院結(jié)直腸外科手術(shù)切除的腸源性卵巢轉(zhuǎn)移癌患者44例及配對(duì)正常黏膜20例和原發(fā)灶25例。年齡(51.0±11.3)歲，其中同時(shí)性轉(zhuǎn)移者15例，異時(shí)性轉(zhuǎn)移者29例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例，44例患者均無其他遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移。

二、免疫組織化學(xué)染色

標(biāo)本均經(jīng)10%福馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。將44例配對(duì)的標(biāo)本行常規(guī)4 μm連續(xù)組織切片，固定于經(jīng)1 g/L多聚賴氨酸防脫片處理的載玻片上，60℃連續(xù)烤片7 h，常溫保存?zhèn)溆?。采用pv-9003法(pv-9003試劑盒購自北京中杉公司)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，切片使用檸檬酸修復(fù)液修復(fù)和過氧化氫封閉后滴加一抗，4℃過夜，次日滴加pv-9003試劑盒中試劑A和B，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

三、結(jié)果判定

Bmi-1蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。本研究采用IRS綜合評(píng)分的方式，高倍鏡下隨機(jī)取2個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及核陽性細(xì)胞數(shù)，按照陽性細(xì)胞所占百分比，陰性表達(dá)為0分；陽性率：1%～10%為1分，11%～30%為2分，31%～50%為3分，51%～80%為4分,>80%為5分。再根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分，陰性為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分，將每張切片平均著色程度得分與平均著色細(xì)胞百分率得分各自相乘，為IRS最終得分：0分為陰性，1～5分為低表達(dá)(+)，6～10分為中度表達(dá)(++)，>10為高度表達(dá)(+++)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，Bmi-1與患者生存期關(guān)系采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Bmi-1與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

Bmi-1在直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)陽性率顯著高于正常黏膜中的表達(dá)(分別為65.9%、15.9%，χ2=22.752,P<0.01)；Bmi-1在卵巢轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)的陽性率與正常黏膜相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.6%、15.9%，χ2=0.090,P=0.764)。Bmi-1在直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)，對(duì)于以下影響因素有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)：結(jié)直腸癌的病理類型(χ2=5.116,P<0.05)、術(shù)前T分期(χ2=4.856,P<0.05)、術(shù)前N分期(χ2=5.495,P<0.05)。而對(duì)于以下影響因素?zé)o明顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：患者的年齡(χ2=0.030,P>0.05)、是否絕經(jīng)(χ2=1.349,P>0.05)、原發(fā)灶部位(χ2=0.271,P>0.05)、腫瘤大小(χ2=0.024,P>0.05)、卵巢轉(zhuǎn)移的時(shí)間(χ2=0.004,P>0.05)。同時(shí)在本研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1異常表達(dá)的患者平均生存期為13.16個(gè)月，明顯低于無Bmi-1異常表達(dá)者的16.87個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.524,P=0.012)。

討論

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。據(jù)國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，其發(fā)病率排在第3位，僅次于肺癌及乳腺癌，而死亡率已居第4位。它是一個(gè)多因素、多步驟逐漸演變的過程，現(xiàn)認(rèn)為其與主要多基因聯(lián)合失調(diào)有關(guān)[10]。腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的器官為肝臟，卵巢轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為1.4%～25%，平均約為7%[11]。Bmi-1可能參與大腸癌的發(fā)生發(fā)展以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[10,12-14].

Bmi-1作為一個(gè)原癌基因c-myc共同參與小鼠T、B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生。Bmi-1基因定位于10號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶(10p13)，含10個(gè)外顯子，其cDNA長(zhǎng)為3 203 bp，其開放閱讀框編碼一種326個(gè)氨基酸的蛋白，相對(duì)分子量為4.4×104～4.6×104[15]。Bmi-1蛋白含有幾個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：(1)位于N-末端的環(huán)指結(jié)構(gòu)(ring finger domin，R)，該結(jié)構(gòu)域保證Bmi-1蛋白均勻分布在細(xì)胞核邊緣易染色質(zhì)集中的區(qū)域是發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用的限制性因素；(2)位于中區(qū)域的重復(fù)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(HTHTHT結(jié)構(gòu)域)，介導(dǎo)Bmi-1蛋白與DNA的結(jié)合；(3)2個(gè)核定位信號(hào)KRRM和KRMK序列；(4)位于C-末端的富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的PEST區(qū)域，該結(jié)構(gòu)與Bmi-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)迅速降解有關(guān)[16]。Bmi-1通過抑制編碼兩種腫瘤抑制因子P16和P19(在人類中是P14)的INK4a-ARF來誘導(dǎo)生長(zhǎng)停滯、細(xì)胞衰老和凋亡。

表1 Bmi-1蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

注：a為Fisher確切概率法

本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的Bmi-1的表達(dá)水平顯著高于正常黏膜，Bmi-1在原發(fā)灶中的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的病理類型、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Bmi-1不僅參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)可能也參與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，這與國內(nèi)外許多報(bào)道的結(jié)果一致。Bmi-1在許多癌灶中存在異常表達(dá)，其中就包括結(jié)直腸癌、卵巢癌，同時(shí)有報(bào)道，在shRNA水平下調(diào)Bmi-1可以抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移[8]，提示Bmi-1不僅是參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)也參與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，但是本研究未發(fā)現(xiàn)Bmi-1在卵巢轉(zhuǎn)移灶中存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，提示Bmi-1在大腸癌卵巢轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的作用及作用的機(jī)制可能與腫瘤轉(zhuǎn)移基因的作用機(jī)制有所不同。雖然現(xiàn)已明確Bmi-1與P16INK4a和P14ARF抑制因子有關(guān)，在結(jié)直腸癌中P16INK4a和P14ARF的缺失可能通過該基因5’、CpG島異常甲基化或同源混合性缺失和基因突變的機(jī)制被誘導(dǎo)，但是Bmi-1在細(xì)胞周期調(diào)控中不同的凋亡機(jī)制、其在不同微環(huán)境中的作用機(jī)制以及其是否具有腫瘤轉(zhuǎn)移基因的作用仍有待于進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1在大腸癌卵巢移灶中未見異常表達(dá)，但是在原發(fā)灶中表達(dá)明顯增高，且這部分患者的生存期明顯縮短，說明Bmi-1與伴有卵巢轉(zhuǎn)移的大腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，可能是結(jié)直腸癌重要預(yù)后相關(guān)因子。

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