Pinch－3蛋白對細胞形態(tài)及牽引力的影響

周 歷，馬德順，楊 毓，高淑云

（沈陽大學 生物與環(huán)境工程學院，遼寧 沈陽110044）

Pinch－3蛋白對細胞形態(tài)及牽引力的影響

周 歷，馬德順，楊 毓，高淑云

（沈陽大學 生物與環(huán)境工程學院，遼寧 沈陽110044）

用基因敲除的方法比較了正常腎小球足細胞和Pinch－3蛋白缺失細胞的形態(tài)差異和牽引力的差異，發(fā)現(xiàn)當Pinch－3蛋白缺失后，細胞表面出現(xiàn)了許多孔隙，同時細胞投影面積平均增加40%；細胞的牽引力則平均減小40%左右，這說明當腎小球足細胞的Pinch－3基因的表達受到抑制以后，細胞膜上產(chǎn)生的孔隙使細胞膜變得松散，進而使得表面積增大.細胞牽引力減小40%，說明細胞膜上的孔隙對細胞牽引力的形成具有較強的影響.

Pinch－3；腎小球足細胞；基因敲除；細胞形態(tài)；影響

細胞形態(tài)和牽引力是細胞的重要物理性質(zhì)，它與細胞的許多生物過程有著密切的關系，比如炎癥反應、創(chuàng)傷修復、血管生成、形態(tài)保持、信號傳導以及新陳代謝等［1］.細胞牽引力由肌動球蛋白的相互作用和肌動蛋白的聚合作用而產(chǎn)生［2－4］，受平滑肌肌動蛋白 （α－SMA）的調(diào)節(jié)［5－6］.不同的細胞其牽引力不同，相同的細胞在不同的發(fā)育階段其牽引力也不一樣［7－9］，例如前交叉韌帶干細胞經(jīng)過一周的分化，其牽引力將減小30%左右［9］.目前，關于細胞牽引力的研究還很有限，國內(nèi)只有北京大學、北京理工大學和沈陽大學報道過該領域的研究成果［10］.Pinch－3蛋白對細胞的形態(tài)保持有著重要作用，它與整合素形成信號復合物，參與細胞的勃著勃附作用，從而調(diào)節(jié)細胞的形態(tài)［11］.為了觀察Pinch－3蛋白對細胞形態(tài)和牽引力的影響，本研究用基因敲除的辦法使Pinch－3基因沉默，用CTFM法測定了腎小球足細胞在基因敲除前后細胞牽引力的變化，觀察和比較了細胞的形態(tài)變化，試圖發(fā)現(xiàn)Pinch－3蛋白對腎小球足細胞的物理性質(zhì)的影響.

1 材料與方法

1.1 人體組織及實驗材料

人體組織腎小球足細胞由芝加哥大學附屬醫(yī)院提供，系28歲健康男性白人，死于車禍；轉染培養(yǎng)基（sc－36868）、Pinch－3 sh RNA和cop GFP對照質(zhì)粒購于美國百泰克公司，DMEM培養(yǎng)液，犢牛血清及所用實驗材料購于西格瑪公司.

1.2 細胞培養(yǎng)

將人體組織腎臟解剖并分離出腎小球足細胞置于培養(yǎng)皿中，充分剪碎、消化和吹打后，將組織懸液以1 000 r／min離心5 min去上清，加入培養(yǎng)液吹打，然后接種于100 m L培養(yǎng)瓶中，加入不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含20%犢牛血清，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2，37℃培養(yǎng).培養(yǎng)1 d換液，去除未貼壁的細胞.用倒置顯微鏡（尼康TE－2000）觀察細胞生長狀態(tài).3 d后取出并用sh RNA轉染培養(yǎng)基（sc－36868）漂洗一次，吸去培養(yǎng)基并迅速進行轉染.

1.3 基因敲除

將Pinch－3 shRNA和cop GFP對照質(zhì)粒加入轉染培養(yǎng)基中，濃度為1 000 ng／μL，小心均勻地覆蓋在漂洗過的細胞上，培養(yǎng)過夜，對照組只用cop GFP對照質(zhì)粒處理，次日將轉染后的細胞移植在測試細胞牽引力的彈性基質(zhì)上，6 h后用熒光顯微鏡進行觀察挑選轉染陽性和陰性對照分別進行形態(tài)觀察和牽引力測算.

1.4 細胞牽引力測算

采用 CTFM（Cell Traction Force Microscopy）技術，即顯微鏡追蹤法測定細胞牽引力技術.這是一種根據(jù)細胞基質(zhì)彈性表面形變來測算細胞牽引力的技術.在制備彈性基質(zhì)時摻入熒光微珠，當細胞貼附后會使基質(zhì)產(chǎn)生形變，當細胞脫離時再回復原位，這種基質(zhì)的形態(tài)變化可以通過熒光微珠的位移表現(xiàn)出來，可以用熒光顯微鏡追蹤觀察.將細胞脫離前后的基質(zhì)形態(tài)變化拍成圖片，用MATLAB 7.0運行專用自編程序進行比較分析即可測算出細胞牽引力.其過程主要分為3個步驟：①拍攝細胞圖片，以確定細胞牽引力的區(qū)域；②分別拍攝細胞貼附時和脫離后的基質(zhì)形態(tài)圖片，以確定熒光微珠的位移；③將拍攝的三張圖片上機分析.

2 結 果

腎小球足細胞轉染以后，形態(tài)上有了明顯的變化，由于Pinch－3蛋白的缺失，在細胞膜表面形成了許多孔隙（圖1），同時表面積明顯增大（圖2）；細胞牽引力則明顯減小，平均減小40%左右（圖3）；這與細胞表面積增大的結果是吻合的.

圖1 基因敲除前后腎小球足細胞形態(tài)對比Fig.1 The comparison of cell morphology of podoeyte cells before and after knockout

圖2 基因敲除前后腎小球足細胞表面積比較Fig.2 The comparison of projected area of podocyte cells before and after knockout

圖3 基因敲除前后腎小球足細胞牽引力比較Fig.3 The comparison of cell traction force of podocyte cells before and after knockout

3 討 論

Pinch－3蛋白對維持細胞形態(tài)具有重要作用，當Pinch－3基因的表達受到抑制，導致細胞膜的一些成分缺失，進而在膜上形成了許多孔隙；同時由于孔隙的增多，使膜的結構變得松散，導致細胞的表面積增大.

細胞牽引力減小的原因應該歸結于細胞表面積的增大，因為細胞牽引力與細胞的投影面積成反比，表面積增大40%，在產(chǎn)生牽引力的其他因子不變的條件下牽引力減少40%，與細胞投影面積增加的結果是一致的.這說明Pinch－3蛋白除了影響細胞膜的組成外，還通過影響細胞表面積間接影響細胞的牽引力.

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Effect of Pinch－3 Protein in Podocytes on Cell Morphology and Cell Traction Force

ZHOULi，MADeshun，YANGYu，GAOShuyun
（College of Biological and Environmental Engineering，Shenyang University，Shenyang 110044，China）

The change of morphology of podocytes was compared and the difference of cell traction force of podocytes was measured before and after knockout Pinch－3 DNA in this experiment.It was found that a number of pores appeared on the cells surface and the cells projected area increased by average of 40%after gene knockout，but the cell traction force of podocyte were significantly reduced by average of 40%.This suggests that when the expression of the podocytes Pinch－3 gene is inhibited，some pores will appear on the cells surface，and these pores make the membrane of the cells become laxer，and then the cells projected area become larger.The cell traction force decrease correspondingly by average of 40%，which suggests that the pores on the cell surface strongly affect the cell traction force.

Pinch－3；podocyte；knockout；cell morphology；effect

Q 28

A

1008－9225（2012）01－0045－03

2011－03－25

沈陽市引智計劃資助項目（D20102101006）.

周 歷（1986－），女，遼寧營口人，沈陽大學碩士研究生；馬德順（1962－），男（回族），遼寧沈陽人，沈陽大學教授，博士.

李 艷】