兔抗小鼠多發(fā)性骨髓瘤細胞多克隆抗體的制備及抗腫瘤研究

母波，梁素華，申躍武，章歡

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室，四川 南充 637000)

兔抗小鼠多發(fā)性骨髓瘤細胞多克隆抗體的制備及抗腫瘤研究

母波，梁素華△，申躍武，章歡

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室，四川 南充 637000)

目的:制備小鼠多發(fā)性骨髓瘤全細胞兔多克隆抗體，并初步研究其抗腫瘤活性。方法:用小鼠多發(fā)性骨髓瘤細胞MPC-11活細胞通過背部皮內(nèi)多點注射多次免疫新西蘭大白兔，收集血清。然后采用親和層析系統(tǒng)純化血清中的多克隆抗體。用ELISA檢測純化多克隆抗體的效價，MTT法分析多克隆抗體對MPC-11增殖的影響，通過皮下腫瘤模型研究多克隆抗體對荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長的影響。結(jié)果:我們獲得了高特異性的多克隆抗體，ELISA檢測抗體滴度在1∶20 000以上，MTT研究發(fā)現(xiàn)200 μg/mL多克隆抗體處理骨髓瘤細胞MPC-11 48 h后，明顯抑制骨髓瘤細胞生長;體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，多克隆抗體明顯抑制小鼠皮下腫瘤的生長。結(jié)論:實驗獲得了高效價的特異性兔抗小鼠骨髓瘤細胞多克隆抗體，通過體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)，多克隆抗體能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長，為進一步研究多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療提供了新的方法。

多發(fā)性骨髓瘤;多克隆抗體;免疫治療

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓內(nèi)漿細胞異常增生的一種惡性腫瘤。雖然常規(guī)的放、化療和干細胞移植等方案使患者的緩解率和無病生存期明顯提高，但最終難免復(fù)發(fā)［1］。近年來，腫瘤分子免疫學(xué)的快速發(fā)展為其治療開辟了新途徑，尤其是以靶向腫瘤特異性抗原的單克隆抗體治療已顯示出重要作用［2］，以Rituximab［3］、alemtuzumab［4］、atlizumab［5］和atlezumab［6］等單克隆抗體最具有希望。然而，因為多發(fā)性骨髓瘤表達多種細胞表面抗原［7］，而呈現(xiàn)出高度異質(zhì)性。另外，患者之間的差異性以及多發(fā)性骨髓瘤治療中出現(xiàn)的藥物耐受等原因，使得單克隆抗體治療多發(fā)性骨髓瘤的效果有限。因此，利用靶向多個抗原的多克隆抗體用于治療多發(fā)性骨髓瘤也許是值得嘗試的方式。為此，本研究利用小鼠多發(fā)性骨髓瘤全細胞免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體并初步研究其抗腫瘤活性，以期為多克隆抗體的研制和多發(fā)性骨髓瘤治療作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠多發(fā)性骨髓瘤細胞MPC-11由四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室楊金亮教授惠贈，福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑和ELISA生色底物(購自Sigma公司)，普通蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(購自BMA公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS)(購自Sigma公司)，二抗(FITC標(biāo)記羊抗兔IgG)購于北京中山金橋生物技術(shù)公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 抗體的制備和純化

將2只雌性新西蘭大白兔(購自四川大學(xué)華西實驗動物中心)先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。每只動物免疫前先于一側(cè)耳緣抽取2 mL靜脈血，4℃靜置過夜，取血清作陰性對照。初次免疫用弗氏完全佐劑加MPC－11細胞(1×107～5×107)背部皮下注射免疫動物，每只新西蘭大白兔注射2～3點，每點注射200 μL;第14天用弗氏不完全佐劑加MPC-11細胞，同樣劑量免疫新西蘭大白兔加強免疫;第28天和38天時再次加強免疫;第45天頸動脈采血80 mL，4℃靜置過夜，取血清。

多克隆抗體的純化用親和層析系統(tǒng)純化(AKTA explore，GE，USA)，將含骨髓瘤細胞多克隆抗體的血清上樣于用10倍柱體積的Buffer A(20 mM NaH2PO4，0.15 M NaCl，pH 7.2～9.0)平衡的XK16/40柱子，填料為Mabselect，再用5倍柱體積的Buffer A洗柱子;用Buffer B(0.1 M sodium citrate，pH 3.0)線性梯度洗柱，直至有洗脫峰的出現(xiàn);收集洗脫峰液體，同時用中和Buffer(1M Tris-HCl，pH8.0)調(diào)節(jié)洗脫液pH7.2左右;將收集的洗脫液用透析袋置于PBS緩沖液(pH7.2)在4攝氏度下透析，將透析的收集液凍干即得骨髓瘤細胞多克隆抗體。對照多克隆抗體按照上述方法純化未免疫新西蘭大白兔血清中免疫球蛋白。

1.3 兔抗人多發(fā)性骨髓瘤全細胞多克隆抗體的ELISA檢測

將MPC-11細胞5×103加到用多聚賴氨酸預(yù)先包被的96孔板，4℃孵育過夜;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h;將5 mg多克隆抗體倍比稀釋(1∶2 000，1∶5 000，1∶10 000和1∶20 000)加入上述各孔，37℃孵育2 h;含體積分?jǐn)?shù)為0.5%Tween20的PBS(PBST)緩沖液洗3次;加入1∶1 000稀釋交聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP)的抗兔二抗，37℃孵育2 h;PBST緩沖液洗3次;加入顯色底物，室溫避光放置15 min;加入1 mol/L HCl終止反應(yīng);用酶標(biāo)儀490 nm測定光密度值(oplical density，OD)。

1.4 MTT實驗分析

培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞MPC-11接種到96孔板，每孔5×103，每組設(shè)三個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，不同濃度的多克隆抗體(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL)處理細胞，分別處理24 h、48 h和72 h，以完全培養(yǎng)基稀釋MTT，終濃度為5 mg/mL，每孔加入20 μL，將細胞放回5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，再吸去含MTT的培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲亞砜(DMSO)，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處讀取吸收值。計算抑制率=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5 多克隆抗體抗腫瘤效應(yīng)的體內(nèi)觀測

將MPC-11細胞在無菌條件下種植于30只6～8周齡BALB/c小鼠右側(cè)背部皮下，接種劑量為100 mL/只，接種細胞數(shù)為5×105個/只，當(dāng)能捫及腫瘤結(jié)節(jié)時隨機將小鼠分為三個組，每組7只。然后分別尾靜脈注射多克隆抗體(200 μg/dose)，對照抗體(200 μg/dose)和生理鹽水，每次注射體積為100 μL，一共注射7次。開始治療后每三天觀察一次并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長、寬徑，記錄小鼠一般狀況和死亡時間;實驗過程中注意觀察小鼠皮毛色澤，有無脫毛，食欲及活動變化以及生存情況。腫瘤體積按照Steel經(jīng)驗公式:腫瘤體積V(mm3)=寬度2×長度×0.5計算，當(dāng)對照組小鼠腫瘤體積達4 000 mm3時，將各組小鼠全部處死。

2 結(jié)果

為了證明通過親和層析純化后所得抗體具有活性，我們通過用細胞ELISA測定抗體的效價。如圖1所示，我們可以發(fā)現(xiàn)，1∶2 000或者1∶5 000稀釋的多克隆抗體比1∶10 000或者1∶20 000稀釋的呈現(xiàn)出更強的抗原結(jié)合特性。并且，與相同滴度對照IgG相比，上述四種滴度的多克隆抗體和抗原結(jié)合能力要高出3～10倍。

不同濃度的多克隆抗體處理骨髓瘤細胞48 h后，作MTT實驗檢測各組細胞增殖活性，計算各組細胞抑制率。以PBS處理為空白對照，對照抗體為陰性對照。如圖2所示，我們發(fā)現(xiàn)多克隆抗體對骨髓瘤細胞的增殖抑制率有濃度劑量效應(yīng)，隨著處理濃度的增加對骨髓瘤細胞增殖的抑制率也有所增加，在200 μg/mL處理時，抑制率超過50%。

為了研究多克隆抗體體內(nèi)抗腫瘤作用，通過運用多克隆抗體尾靜脈注射治療荷瘤小鼠，觀察皮下腫瘤生長情況發(fā)現(xiàn)，如圖3所示，與NS和對照抗體處理組小鼠相比，多克隆抗體明顯抑制腫瘤生長。

3 討論

在過去幾十年來，由于MM異質(zhì)性和MM細胞與微環(huán)境的復(fù)雜性，多發(fā)性骨髓瘤的常規(guī)化療治療，高劑量的放療和/或異基因干細胞移植效果都不理想［8］，基于抗體免疫治療提供了潛在的治療惡性腫瘤方法［9］。針對細胞表面抗原的單克隆抗體治療是一種非常具有吸引力的手段［10］。Rituximab的臨床效果令人印象深刻，因此成為第一個由FDA批準(zhǔn)用于人類惡性腫瘤使用單克隆抗體［11］。目前其他一些有希望的單克隆抗體也被用于臨床前和臨床研究［12－14］。但是因為特定的MM相關(guān)抗原表達存在差異性［10］以及一些骨髓瘤細胞表達補體級聯(lián)抑制蛋白從而逃避抗體介到的補體依賴細胞毒作用以及長期用藥而產(chǎn)生的耐藥性［15］等原因，致使單克隆抗體療效有限，迫切需要尋求更為廣泛表達的多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)抗原和探索更有療效的抗體。在本研究中，我們利用小鼠多發(fā)性骨髓瘤細胞系MPC-11活細胞免疫新西蘭大白兔，純化血清獲得多克隆抗體。通過MTT法分析發(fā)現(xiàn)，200 μg/mL多克隆抗體在48 h抑制MPC-11細胞活性50%以上，皮下腫瘤模型研究顯示多克隆抗體明顯抑制小鼠皮下腫瘤的生長。綜上實驗結(jié)果，通過體內(nèi)體外研究，多克隆抗體能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長，為進一步研究多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療提供了新的方法。以前的研究表明多克隆抗體rATG［16］和Thymoglobulina可以識別骨髓瘤細胞表面與凋亡途徑或生長因子受體途徑相關(guān)的蛋白，比如HLA－ABC、HLA－DR、CD32(FcRγ2)、CD19、CD20、CD30、CD38、CD95、CD126(IL-6R)和CD138。我們推測，抗骨髓瘤的多克隆抗體抗腫瘤活性可能也與細胞表面分子和其他目前未知分子相關(guān)，其機制需要進一步研究。因此，我們下一步將對多克隆抗體作用靶點進行追蹤分離、鑒定，并系統(tǒng)研究其在動物體內(nèi)的作用及其機制，為將其開發(fā)成為抗癌新藥奠定基礎(chǔ)。

(致謝:本論文實驗研究均在四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室完成，實驗過程得到魏于全院士，楊金亮教授的悉心指導(dǎo)，在此表示衷心感謝。)

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Preparation and anti-tumor research of polyclonal antibodies of rabbit anti-mouse multiple myeloma cells

MU Bo，LIANG Su-hua△，SHEN Yue-wu，ZHANG Huan
(Department of Medical Biology，Key Laboratory of Medical Imaging of Sichuan Province，North Sichuan Medical college，Nanchong 637000，Sichuan，China)

Objective:To prepare rabbit polyclonal antibodies with mouse multiple myeloma cells and study its antitumor activity.Methods:The polyclonal antibody was generated by multi-point immunizing New Zealand white rabbits with live MPC-11 cells.The serum was pooled a week after the last injection.Immunoglobulin was isolated for using an affinity chromatography system and then freeze dried.Elisa was employed to detect and identify the specific binding of PAb and inhibited multiple myeloma cell proliferation as revealed by MTT assay.Serial intravenous injections of PAb inhibited tumor growth in mice bearing murine multiple myeloma cells.Results:Highly specific polyclonal antibodwere obtaines.ELISA detection found that antibody titers were more than 1∶20 000，The MTT study found that the cytotoxicity of PAb on MPC-11 cell lines was both dose-dependent and time-dependent.The PAb exerted a 50%inhibitory effect on MPC-11 cell viability at a concentration of 200.0 μg/mL in 48 h and the polyclonal antibody significantly inhibited the growth of subcutaneous tumors in mice by in vivo study.ConclusionHigh specific rabbit anti-mouse myeloma cell polyclonal antibody can be obtrained.The study results show that the polyclonal antibody can significantly inhibit tumor cell growth in vitro and in vivo，The data also suggests that PAb is an effective agent for multiple myeloma therapy and that exploratory clinical trials may be warranted.

Multiple myeloma;Polyclonal antibody;Immunotherapy

1005-3697(2012)04-0331-04

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.04.007

國家自然科學(xué)基金項目(81101733);四川省教育廳重點項目(10ZA168)

2012-05-18

母波(1980－)，男，博士，講師，主要從事腫瘤生物治療研究。

△通訊作者:梁素華，E-mail:liang830322@163.com網(wǎng)絡(luò)出版時間:2012-7-80∶29

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20120708.0029.201204.331_007.html

(學(xué)術(shù)編輯:胡為民)