生物發(fā)光快速測定生乳菌落總數(shù)的方法

宋子明，孫中鋒，侯彩云，史?，?，金江玉，劉思露

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100083；3.北京潤德康泰生物科技有限公司，北京 100176）

生物發(fā)光快速測定生乳菌落總數(shù)的方法

宋子明1,2，孫中鋒3，侯彩云1,2，史?，?,2，金江玉1,2，劉思露3

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100083；3.北京潤德康泰生物科技有限公司，北京 100176）

為消除利用ATP生物發(fā)光法測定生乳菌落總數(shù)時非細(xì)菌ATP對測定結(jié)果的干擾，建立了一種樣品前處理方法。利用ATP生物發(fā)光法對經(jīng)過前處理的生乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，生乳菌落總數(shù)對數(shù)值與生乳細(xì)菌ATP發(fā)光對數(shù)值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系 （R2=0.982），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（P＜0.01），說明該前處理方法能夠有效排除非細(xì)菌ATP的干擾，有利于提高ATP生物發(fā)光法定量測定生乳菌落總數(shù)準(zhǔn)確性。

ATP生物發(fā)光法；生乳；菌落總數(shù)

0 引 言

生物發(fā)光法能夠快速測定微生物數(shù)量，其反應(yīng)機(jī)理[1]是：熒光素酶以熒光素、ATP和O2為底物，在Mg2+存在時，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出光量子。ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是生物生命活動的能量來源，存在于所有活體細(xì)胞中。ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系[2]，各生長時期的細(xì)菌又有較恒定水平的ATP含量[3]。而當(dāng)微生物死亡后，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，ATP會很快被分解。因此，可用生物發(fā)光法來測定活菌數(shù)。

生乳中含有一定量的游離ATP和大量的體細(xì)胞，在提取細(xì)菌ATP時，也會將體細(xì)胞中的ATP提取出來，而以體細(xì)胞ATP為主的非細(xì)菌ATP量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌，會干擾細(xì)菌ATP的測定。本研究建立了一種樣品前處理方法，能夠有效排除非細(xì)菌ATP的干擾。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

RBL-1生物發(fā)光微生物檢測儀，MK320干式恒溫器，D-37520高速離心機(jī)。

體細(xì)胞ATP提取劑 （SAE），細(xì)菌ATP提取劑（BAE），發(fā)光檢測液，小鼠骨髓瘤細(xì)胞，生乳。

1.2 方法

1.2.1 體細(xì)胞ATP提取劑對細(xì)菌的影響

取100 μL生乳，均勻涂布于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上，表面水分干燥后，將平板翻轉(zhuǎn)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。用無菌超純水反復(fù)沖洗瓊脂培養(yǎng)基表面，吸取100 μL生乳細(xì)菌，加入液態(tài)培養(yǎng)基中，37℃條件下震蕩培養(yǎng)4小時，得到生乳細(xì)菌的培養(yǎng)液。

取1 mL生乳細(xì)菌培養(yǎng)液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入1 mL無菌超純水復(fù)溶。重復(fù)以上操作兩次，以除去死亡的細(xì)菌和游離ATP。取100 μL生乳細(xì)菌，加入到100 μL體細(xì)胞ATP提取劑（SAE）或細(xì)菌ATP提取劑（BAE）中，于25℃條件下分別反應(yīng)1，10，20，30 min。 取50 μL反應(yīng)液，加入到1 mL發(fā)光檢測液中，測發(fā)光值。以生乳細(xì)菌加入無菌超純水的發(fā)光值作為對照。

1.2.2 生乳中非細(xì)菌ATP的干擾因素的排除

取1 mL小鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)液（體細(xì)胞計數(shù)為1×106mL-1），2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL無菌生理鹽水復(fù)溶。再次2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL無菌生理鹽水復(fù)溶。取100 μL小鼠骨髓瘤細(xì)胞液與100 μL體細(xì)胞ATP提取劑混合，于25℃條件下分別反應(yīng)1，5，10，15，20，30 min。 取反應(yīng)液50 μL加入到1 mL發(fā)光檢測液中，測定發(fā)光值。

取100 μL生乳與100 μL體細(xì)胞ATP提取劑混合，于25℃條件下分別反應(yīng)1，5，10，15，20，30，40，50，60 min。取反應(yīng)液50 μL加入到1 mL發(fā)光檢測液中，測定發(fā)光值。

1.2.3 ATP生物發(fā)光法測定生乳中的菌落總數(shù)

取兩支離心管，分別加入生乳樣品50 μL，加入體細(xì)胞ATP提取劑50 μL，混勻，25℃條件下反應(yīng)30 min。30 min后，向一支離心管中加入無菌超純水100 μL，向另一支離心管中加入細(xì)菌ATP提取劑100 μL，25℃條件下反應(yīng)1 min。分別取兩支離心管中反應(yīng)液50 μL，加入到1 mL發(fā)光檢測液中，測定發(fā)光值，計算兩份反應(yīng)液發(fā)光值之差，即為生乳中細(xì)菌ATP的發(fā)光值。

對ATP生物發(fā)光法測定過的生乳樣品細(xì)菌進(jìn)行平板計數(shù)，具體步驟如下：用無菌超純水將生乳樣品10倍梯度稀釋，根據(jù)對樣品中細(xì)菌量的估計，選擇2～3個稀釋度的樣品稀釋液，吸取樣品稀釋液100 μL，均勻涂布于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行。37℃培養(yǎng)24 h。選取菌落數(shù)在30～300 mL-1之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)，每個稀釋度的菌落數(shù)取3個平板的平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體細(xì)胞ATP提取劑對細(xì)菌的影響

當(dāng)反應(yīng)時間分別為1，10，20，30 min時， 以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的發(fā)光值（RLU）為縱坐標(biāo)，所得結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，加入體細(xì)胞ATP提取劑（SAE）的生乳細(xì)菌發(fā)光值隨著反應(yīng)時間的延長，沒有明顯變化，與空白對照組基本相同，說明體細(xì)胞ATP提取劑對生乳細(xì)菌無明顯影響；加入細(xì)菌ATP提取劑（BAE）的生乳細(xì)菌發(fā)光值在1 min時，即達(dá)到峰值，在1 min后，隨著反應(yīng)時間的延長，發(fā)光值基本保持不變，說明細(xì)菌ATP提取劑對生乳細(xì)菌ATP的提取效果明顯，1 min內(nèi)即可完成生乳ATP的提取過程。

2.2 生乳中非細(xì)菌ATP的干擾因素的排除

當(dāng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)時間分別為1，5，10，15，20，30 min時，以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的發(fā)光值（RLU）為縱坐標(biāo)，所得結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，小鼠骨髓瘤細(xì)胞與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)液的發(fā)光值逐漸降低，且30 min時的發(fā)光值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1 min時的發(fā)光值。由于體細(xì)胞ATP提取劑的作用，體細(xì)胞ATP逐漸被分解，反應(yīng)液中體細(xì)胞ATP量逐漸降低，且30 min時大部分體細(xì)胞ATP已被分解掉。

當(dāng)生乳與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)時間分別為1，10，20，30，40，50，60 min時， 以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的發(fā)光值（RLU）為縱坐標(biāo)，所得結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，生乳與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)液的發(fā)光值逐漸降低。30 min內(nèi)發(fā)光值下降比較明顯，30 min時剩余非細(xì)菌ATP的發(fā)光值已經(jīng)降到一個相對較低的水平。由于體細(xì)胞ATP提取劑的作用，體細(xì)胞ATP逐漸被分解，反應(yīng)液中體細(xì)胞ATP含量逐漸降低，且30 min時大部分體細(xì)胞ATP已被分解掉。

2.3 ATP生物發(fā)光法測定生乳中的菌落總數(shù)

以生樣品乳菌落總數(shù)的自然對數(shù)（SPC）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的生乳細(xì)菌ATP發(fā)光值的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，所得曲線如圖4所示，一元線性方程為Y=0.762X-1.983，R2=0.982，P＜0.01。

生乳菌落總數(shù)對數(shù)值與生乳細(xì)菌ATP發(fā)光對數(shù)值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（R2=0.982），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（P＜0.01），表明本研究所用前處理方法能夠有效排除非細(xì)菌ATP的干擾，有利于提高ATP生物發(fā)光法定量測定生乳菌落總數(shù)準(zhǔn)確性。

3 討 論

在利用ATP生物發(fā)光法測定生乳樣品中菌落總數(shù)時，Samkutty等[4]利用體細(xì)胞ATP提取劑將體細(xì)胞中ATP提取出來，通過濾膜加壓過濾，將非細(xì)菌ATP被濾掉，以此排除非細(xì)菌ATP的干擾。管勇佳等[5]在利用ATP生物發(fā)光法測定生乳樣品中體細(xì)胞數(shù)時，為了排除生乳中游離ATP的干擾，首先測定生乳中游離ATP的發(fā)光值，然后向生乳中加入體細(xì)胞ATP提取劑，測其發(fā)光總值，最后用總值減游離ATP的發(fā)光值，得到體細(xì)胞中ATP的發(fā)光值。

本研究中，小鼠骨髓瘤細(xì)胞與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)時，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)液的發(fā)光值逐漸降低，說明反應(yīng)液中體細(xì)胞ATP逐漸被消除。在體細(xì)胞ATP提取劑提取ATP時，體細(xì)胞內(nèi)的ATP水解酶或轉(zhuǎn)化酶同時被釋放出來[6]，并將ATP水解或轉(zhuǎn)化，因此可以利用體細(xì)胞自身的ATP水解酶或轉(zhuǎn)化酶水解或轉(zhuǎn)化非細(xì)菌ATP。生乳與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)液的發(fā)光值逐漸降低，說明生乳中非細(xì)菌ATP逐漸被生乳體細(xì)胞內(nèi)的ATP水解酶或轉(zhuǎn)化酶水解或轉(zhuǎn)化。且反應(yīng)液的發(fā)光值30 min內(nèi)下降比較明顯，30 min時剩余非細(xì)菌ATP的發(fā)光值已經(jīng)降到一個相對較低的水平，對生乳中細(xì)菌ATP含量測定的干擾相對較小。

本研究得到一種新的樣品前處理的方法：生乳與體細(xì)胞ATP提取劑反應(yīng)30 min，測得剩余非細(xì)菌ATP的發(fā)光值，作為樣品本底值；然后加入細(xì)菌ATP提取劑，反應(yīng)1 min，測得ATP發(fā)光值，作為總值；總值與樣品本底值之差即為生乳中細(xì)菌ATP的發(fā)光值。利用ATP生物發(fā)光法對經(jīng)過前處理的生乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，生乳菌落總數(shù)對數(shù)值與生乳細(xì)菌ATP發(fā)光對數(shù)值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系（R2=0.982），相關(guān)程度為顯著相關(guān)（P＜0.01），說明該前處理方法能夠有效排除非細(xì)菌ATP的干擾，有利于提高ATP生物發(fā)光法定量測定生乳菌落總數(shù)準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種生乳樣品前處理的方法，大量生乳樣品測定表明，該前處理方法能有效排除非細(xì)菌ATP的干擾，有利于提高ATP生物發(fā)光法定量測定生乳菌落總數(shù)的準(zhǔn)確性。

[1]MCELROY W D,STREMER B L.Factors Influencing the Response of the Bioluminescent to Adenosine Triphosphate[J].Arch.Biochenl.，1949,22：420-433.

[2]LAROSSA R A.Methods in Molecular Biology,Vol.102：Bioluminescence Methods and Protocols,Totowa[M].New Jersey：Human Press,1998,3-20.

[3]D’EUSTACHIO A J,LEVIN E I.Levels of Adenosine Triphosphate During Bacterial Growth[M].Bacteriol Proc,1967,67：119.

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[5]管勇佳,富鑫,陳曉義,等.ATP生物發(fā)光技術(shù)快速檢測牛乳體細(xì)胞數(shù)[J].中國乳品工業(yè),2010,38（9）：49-50.

[6]YANG N Z,HO W M,CHEN Y H,et al.A Convenient One-Step Extraction of Cellular ATP Using Boiling Water for the Luciferin-Luciferase Assay of ATP[J].Analytical Biochemstry,2002,306：323-327.

Research on rapid assessment on aerobic bacterial count of raw milk using ATP bioluminescence

SONG Zi-ming1,2,SUN Zhong-feng3,HOU Cai-yun1,2,SHI Hai-ying1,2,JIN Jiang-yu1,2,LIU Si-lu3
（1.College of Food Science and Nutrition Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Key Laboratory of Functional Dairy;Co-constructed by Ministry of Education and Beijing Municipality;Beijing 100083,China;3.Beijing Ruddock Biotech Co.,Ltd,Beijing,100176,China）

When assessing the aerobic bacterial count of raw milk using ATP bioluminescence,the results will be interfered by the abacterial ATP.A new pretreatment method was established in this research.Raw milk samples were pretreated before ATP determination,which was measured in relative light units（RLUs）.And the Lumac ATP bioluminescence assay results were compared with standard plate counts（SPCs）.The results indicated that ln-transformed SPCs in raw milk had linear correlation with ln-transformed RLUs（R2=0.982）,and the correlation level was significant（P＜0.01）.It was indicated that the pretreatment method established in this research could eliminate interference from the abacterial ATP efficiently,which would increase the accuracy of quantitative determination of the aerobic bacterial count in raw milk using ATP bioluminescence.

ATP bioluminescence;raw milk;aerobic bacterial count

TS252.7

A

1001-2230（2012）09-0039-03

2012-01-04

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2009360070450）。

宋子明（1986-），男，碩士，從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

孫中鋒