α-甘露糖苷酶法測定家兔血清中苦馬豆素含量

王 帥，吳書奇，陳根元，胡建軍，張 玲，馬春暉

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300）

苦馬豆素（swainsonine，SW）是小花棘豆等瘋草的主要有毒成分，嚴(yán)重影響了新疆畜牧業(yè)的發(fā)展［1-2］。SW有調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫功能的作用，該作用與SW的濃度密切相關(guān)。目前，SW的免疫學(xué)研究已成為熱點(diǎn)，因此，動(dòng)物血清中SW含量的測定顯得極為重要。目前，國內(nèi)采用的苦馬豆素含量測定方法有薄層色譜掃描法［3］、α-甘露糖苷酶法［4-5］、氣相色譜法［6］和高效液相色譜法［7］。薄層色譜掃描法重現(xiàn)性和精確性都較差；氣相色譜法前處理繁瑣，檢測樣品易受蒸氣壓、溫度等的限制，而且苦馬豆素不易氣化，需進(jìn)行衍生化處理，其應(yīng)用也受到限制；高效液相色譜法需要的儀器特殊，溶劑系統(tǒng)選擇也不成熟，需要進(jìn)一步研究［5-7］。目前，關(guān)于α-甘露糖苷酶法測定家兔血清中SW含量的文獻(xiàn)報(bào)道較少。α-甘露糖苷酶活性抑制分析屬于酶分析法（enzymatic assay）。α-甘露糖苷酶可降解甘露糖苷，而SW與α-甘露糖苷酶的結(jié)構(gòu)相似，能競爭性抑制α-甘露糖苷酶的活性，且隨著SW濃度的變化，這種抑制作用的強(qiáng)弱也發(fā)生相應(yīng)變化，可以通過測定甘露糖苷或其分解產(chǎn)物的量間接測定SW的含量。當(dāng)SW的濃度達(dá)到0.5μg/mL以上時(shí)就對α-甘露糖苷酶表現(xiàn)出抑制作用，且該抑制作用與溶液pH密切相關(guān)［4-5］。本試驗(yàn)旨在建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的SW含量測定方法，為測定試驗(yàn)動(dòng)物血清、組織、排泄物、胃腸內(nèi)容物等中SW的含量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 小花棘豆樣品于2010年8月采自新疆克州阿合奇縣色帕巴依鄉(xiāng)（40°59′2′′N，78°42′28′′E），采集時(shí)正值結(jié)實(shí)期，標(biāo)本由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)學(xué)科組鑒定。

試驗(yàn)動(dòng)物：家兔8只，雌雄各半（雌兔的編號為1、3、5、7，雄兔的編號為 2、4、6、8）。體重（2.0±0.1）kg/只，購于塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)基地。每只家兔以10 g/（d·kg）飼喂小花棘豆。試驗(yàn)開始后每隔7 d采集血液一次，并分離血清，-20℃保存。共采血5次。

試劑：苦馬豆素（SW）標(biāo)準(zhǔn)品，SIGMA；α-甘露糖苷酶、對硝基苯基-α-D-甘露糖苷，美國SUPELCO；其它試劑如氫氧化鈉、檸檬酸等均為國產(chǎn)分析純。

儀器：PowerWave XS型全波長酶標(biāo)儀，美國；MR231型高速冷凍離心機(jī)，法國Jouan；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)，美國Millipore；BCD-223GB型冰箱，廣東科龍電器；FA/4A型電子天平，上海精密電子儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 技術(shù)路線 試驗(yàn)反應(yīng)器皿為96孔酶標(biāo)板。向酶標(biāo)板每孔中依次加入反應(yīng)緩沖溶液50 μL、0.025 u/mL α-甘露糖苷酶溶液 50 μL、待測樣品液 50 μL，混勻后37℃孵育15 min；然后加入底物（20 mmol/L對硝基苯基-α-D-甘露糖苷溶液）50 μL，混勻后 37℃孵育 90 min；孵育結(jié)束后加入反應(yīng)終止液（pH 9.8的硼酸鈉緩沖溶液）100μL，立即使用酶標(biāo)儀測吸光度值。測定波長405 nm［5］。

1.2.2 試驗(yàn)條件的選擇 于酶標(biāo)板第1行的各孔中加入pH 2.5的反應(yīng)緩沖溶液50 μL，第2行的其余各孔中加入 pH 3.0 的反應(yīng)緩沖溶液 50 μL；第 3、4、5、6、7、8 行各加入 pH 值為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 的反應(yīng)緩沖溶液50 μL；然后第1列和第2列不添加SW標(biāo)準(zhǔn)品溶液，第3列和第4列加入濃度為10-5mol/L的SW標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL，第5列和第6列加入濃度為10-6mol/L的SW標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL，依此類推，最后向第11列和12列加入濃度為10-9mol/L的SW標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL［5］；最后各孔中加入0.025 u/mL α-甘露糖苷酶溶液50 μL，混勻后立即37℃孵育15 min；然后加入底物（20 mmol/L對硝基苯基-α-D-甘露糖苷溶液）50 μL，混勻后37℃孵育90 min；孵育結(jié)束后加入反應(yīng)終止液（pH 9.8的硼酸鈉緩沖溶液）100 μL，立即使用酶標(biāo)儀測吸光度值。測定波長405 nm。以第1列和第2列的平均值作為100%α-甘露糖苷酶活性，計(jì)算不同SW濃度下α-甘露糖苷酶活性變化。篩選吸光度值變化呈線性相關(guān)的條件為樣品測定方法。

1.2.3 苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確配制1.73（10-6mol/L）、0.865（5×10-7mol/L）、0.433（2.5×10-7mol/L）、0.217（1.25×10-7mol/L）、0.109 mg/mL（6.25×10-8mol/L）5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的SW標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)濃度梯度做8孔。以SW濃度Y對其吸光度X進(jìn)行回歸分析。

1.2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn) 精密量取0.865 mg/mL SW標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL于96孔酶標(biāo)板中，然后加入50 μL 1.73 mg/mL SW標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定吸光度值，共做8孔。

1.2.5 血清樣品的測定 每個(gè)血清樣品做8孔，以未采食小花棘豆的正常兔血清作為陰性對照，計(jì)算血清中SW含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用EXCEL 2007進(jìn)行處理，用SPSS 11.5中One-Way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件的確定 當(dāng)反應(yīng)緩沖液的pH值為4.5時(shí)不同濃度SW溶液反應(yīng)光度值變化線性相關(guān)度最好。根據(jù)圖1所示，隨著SW濃度的升高，α-甘露糖苷酶的活性逐漸降低。當(dāng)SW的濃度在10-9～10-5mol/L范圍內(nèi)時(shí)，α-甘露糖苷酶的活性呈“S”形；當(dāng)SW濃度不低于10-8mol/L時(shí)，對α-甘露糖苷酶的抑制作用明顯增強(qiáng)；當(dāng)SW濃度高于10-6mol/L時(shí)，α-甘露糖苷酶的活性全部被抑制。根據(jù)SW濃度與與其抑制的AMA活性百分比做線性回歸，結(jié)果SW濃度在10-8～10-6mol/L時(shí)SW濃度與其抑制的α-甘露糖苷酶活性呈線性關(guān)系。

2.2 苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以SW濃度Y對其吸光度X（見表1）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y=-0.012X+0.034，R2=0.999（圖 2），表明 SW 濃度在 0.109～1.73 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)8次重復(fù)測定的RSD值，α-甘露糖苷酶法測定苦馬豆素含量的精密度較好。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果 待測樣中SW質(zhì)量0.140 7 mg，理論值0.139 8 mg，平均回收率100.64%，RSD=2.743%。結(jié)果見表2。

圖1 SW抑制α-甘露糖苷酶劑量范圍的測定結(jié)果

表1 苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

圖2 苦馬豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品中SW的含量 試驗(yàn)家兔血清中SW的含量結(jié)果見表3。7 d時(shí)試驗(yàn)兔的血清SW含量差異明顯。這可能與兔子的個(gè)體差異有關(guān)；而且在飼喂小花棘豆的初期，部分試驗(yàn)兔采食情況不佳，也可能導(dǎo)致血清樣品中SW含量的差異。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，同種性別的試驗(yàn)兔血清SW含量差異趨于不顯著，且雄性試驗(yàn)兔的數(shù)據(jù)更為整齊。家兔血清中SW的含量隨著飼喂時(shí)間的延長呈現(xiàn)由低到高的趨勢，由此說明α-甘露糖苷酶法測定家兔血清中SW含量的方法能夠滿足試驗(yàn)研究。另外，雌性試驗(yàn)兔血清SW含量一直顯著高于雄性試驗(yàn)兔，說明雌性家兔較雄性家兔易發(fā)生小花棘豆中毒。這與沈明華等［8］報(bào)道的雌性家兔甘肅棘豆中毒癥狀的出現(xiàn)時(shí)間早于雄性家兔的研究結(jié)果一致。

表3 樣品中苦馬豆素含量 mg/L

3 討論

3.1 不同方法測定血清SW含量的比較 目前國內(nèi)外所采用的方法主要有薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜分析法和酶法測定等。薄層掃描法簡單快捷，易于操作，但用于定量分析時(shí)誤差較大［3］。高效液相色譜分析的檢測器檢測的是樣品中的發(fā)色基團(tuán)，需要將苦馬豆素衍生化，而且高效液相色譜分析所需儀器較復(fù)雜，成本較高，不利于推廣［5，7］。目前SW定量測定應(yīng)用最多的是氣相色譜法，該方法具有檢出率高，檢測速度快，可實(shí)時(shí)監(jiān)測SW合成過程，適用于精確分析樣品中苦馬豆素含量；但SW不易氣化，高溫下易發(fā)生脫水從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變，故檢測時(shí)需制備易升華且穩(wěn)定的SW衍生物，而且對血清樣品的前處理極為繁瑣［6］，所以目前SW的氣相色譜分析更多的應(yīng)用于植物樣品分析中。α-甘露糖苷酶活性抑制分析法多用于血清中SW的定性定量分析［9-10］，由于血液中各種有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)離子較多，采用色譜法很難分離完全，定量分析就更為困難；而酶分析法不需要對樣品進(jìn)行分離，也不需要復(fù)雜的儀器，簡單而適用，同時(shí)可跟蹤分析血清中SW的含量。而且酶分析法靈敏度高，適用于血清、乳制品等樣品中SW含量的微量分析。

3.2 α-甘露糖苷酶法測定SW含量的影響因素 Dorling等［11］研究發(fā)現(xiàn)SW在pH 4.0左右時(shí)對刀豆屬α-甘露糖苷酶表現(xiàn)出抑制作用。Kim等［12］利用酶分析法繪制出了刀豆屬α-甘露糖苷酶活性與SW濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。Scaman等［13］報(bào)道了一種簡單且通用的分光光度分析法測定α-甘露糖苷酶的活性，可用于天然底物或人工合成底物。這些為α-甘露糖苷酶活性抑制分析法測定SW含量提供了基礎(chǔ)。Taylor等［4］以此發(fā)展了一種定性定量分析血清、乳中SW含量的方法。將樣品置于微孔板中并加入檸檬酸鹽緩沖液和α-甘露糖苷酶于37℃下孵育，以對硝基苯基-α-D-甘露糖苷作為底物，反應(yīng)完全后，采用分光光度法測定產(chǎn)物的光密度以間接評價(jià)樣品中的SW含量。α-甘露糖苷酶活性抑制分析法的靈敏度直接依賴于SW對α-甘露糖苷酶活性抑制程度，如果SW濃度過低，對α-甘露糖苷酶活性抑制作用就不明顯，使用酶分析法就無從談起。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)苦馬豆素濃度在10-9～10-6mol/L范圍內(nèi)，反應(yīng)pH值為4.5時(shí)，α-甘露糖苷酶分析法具有較好的準(zhǔn)確性，與孔祥雅等［5］的研究結(jié)果較為一致。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用α-甘露糖苷酶法測定血清中SW的含量。數(shù)據(jù)表明，α-甘露糖苷酶法具有回收率和準(zhǔn)確度高、精密度好、靈敏可靠、操作簡便快速、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為血清SW的微量定量檢測方法。

［1］王帥.新疆小花棘豆中苦馬豆素的提取方法研究［D］.阿拉爾：塔里木大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010.

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