高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中磺胺多辛的不確定度評定

張厚森* 武曉靜 王 瑋 方文娟

（江蘇省理化測試中心，江蘇省營養(yǎng)成分與有毒有害物質(zhì)檢測中心，南京 210042）

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中磺胺多辛的不確定度評定

張厚森* 武曉靜 王 瑋 方文娟

（江蘇省理化測試中心，江蘇省營養(yǎng)成分與有毒有害物質(zhì)檢測中心，南京 210042）

對高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中磺胺多辛含量過程中引入的不確定度進行了分析和評定，通過試驗計算出豬肉中磺胺多辛含量測量結(jié)果的不確定度。在置信水平為95%，包含因子k=2時，其相對擴展不確定度8.58%；當磺胺多辛含量為35.37 μg/kg，其擴展不確定度為3.03 μg/kg。樣品的前處理所引入的不確定度對合成不確定度的貢獻最大。

不確定度；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；磺胺多辛；豬肉

磺胺多辛（Sulfadoxine） 又名周效磺胺，磺胺鄰二甲氧嘧啶，是一種應(yīng)用較廣的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）?；前范嘈翆匍L效磺胺類藥物，具廣譜抗菌作用，作為一種化學抗菌消炎藥物其主要用于預(yù)防和治療細菌感染性疾病?；前范嘈翆π笄菁膊】刂坪椭委熎鸬街匾饔茫腔前奉愃幬锎嬖谥鴩乐氐母弊饔?，人體中長期存在磺胺類藥物會導致許多細菌對其產(chǎn)生耐藥性，且具有潛在的致癌性。當前，國家逐漸加大了對畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留的監(jiān)管力度，我國農(nóng)業(yè)部第235號文件規(guī)定在動物源性食品中磺胺類藥物的總殘留限量為100 μg/kg。

目前液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS） 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于磺胺類獸藥殘留方面的檢測。筆者參照國家計量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評定與表示》和GB/T 21316-2007的要求，對高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中磺胺多辛的不確定度進行了分析與評定。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）配有ESI源，型號Agilent1260-6430；氮吹裝置，天津奧特賽因斯儀器有限公司；色譜柱為Agilent ZORBAXSBC18柱（2.1mm*50mm，1.8μm）；0.22μm水相濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

磺胺多辛，德國Dr.Ehrenstorfer公司；豬肉，客戶提供；化學試劑均為分析純，國藥集團；甲醇、乙腈均為色譜純，美國TEDIA公司。

1.2 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18柱（2.1 mm*50 mm，1.8 μm）；流動相：質(zhì)量分數(shù)0.1%的甲酸-乙腈（體積比為7∶3）；流速0.20 mL/min；柱溫35℃；進樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源為電噴霧正離子模式（ESI+），噴霧器壓力15.0 Psi；質(zhì)譜掃描采集方法為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；脫溶劑氣為氮氣，溫度350℃，流量12 L/min；碰撞氣為高純氮氣；毛細管電壓4000V。

1.3 測試方法

精密稱取2 g經(jīng)絞肉機處理均勻的豬肉樣品于50 mL的塑料離心管中，加入15 g經(jīng)干燥過的無水硫酸鈉和20 mL分析純的乙腈溶液，用勻漿機以8 000 r/min均漿提取2 min，以4 000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)入濃縮燒瓶中，殘渣再分別用15 mL的乙腈按以上步驟重復(fù)提取兩次，合并提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40℃水浴減壓蒸干，準確加入1 mL流動相溶液和1 mL用上述溶液飽和過的正己烷震蕩并超聲5 min溶解殘渣。將以上溶液轉(zhuǎn)移至5 mL具塞聚乙烯塑料離心管中，漩渦1 min，以3 000 r/min離心3 min，棄去上層正己烷，再加入1mL上述正己烷重復(fù)以上步驟至下層水相變?yōu)橥该饕后w，將下層清液過0.22 μm的濾膜，設(shè)定進樣量10 μL后用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

用相應(yīng)的空白樣品提取液配制一系列的基質(zhì)標準液，使其質(zhì)量濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L 和 200 μg/L，待上機測試，以色譜峰面積對質(zhì)量濃度作線性回歸標準曲線用以定量。

1.4 評定數(shù)學模型

磺胺多辛含量計算公式：

式中：X—樣品中磺胺多辛含量，μg/kg；

ρ—經(jīng)處理待上機樣品溶液中磺胺多辛的質(zhì)量濃度，μg/L；

V—待上機樣品溶液的體積，mL；

m—試樣質(zhì)量，g；

fR—磺胺多辛的回收率校正系數(shù)。

2 不確定度的主要組成部分

本試驗涉及到的對測試結(jié)果有直接影響的儀器有天平和液質(zhì)聯(lián)用儀，在測試過程中所用到的量具和實驗室的環(huán)境溫度對結(jié)果也有一定的影響，樣品的前處理，測試過程的隨機效應(yīng)以及標準曲線建立的過程對測試結(jié)果的不確定度也有較大的影響。可將以上不確定度的來源歸屬于以下幾個方面：

a）樣品稱量操作引入的不確定度；

b）定容過程中體積引入的不確定度；

c） 液質(zhì)聯(lián)用儀儀器本身所引入的不確定度，包括儀器自帶的進樣針、工作站自動積分器、儀器的穩(wěn)定性等，主要由儀器的校準證書來確定；

d）樣品前處理過程引入的不確定度，主要包含萃取、濃縮和純化等步驟，其中每一個操作步驟都會引入不確定度，其不確定度因素較多。此不確定度可通過對標準添加量的回收率測定進行判定；

e） 測試過程的隨機效應(yīng)所引入的不確定度，可通過對同一個樣品重復(fù)平行測定后的結(jié)果進行計算和評定；

f）標準溶液配制過程引入的不確定度。

3 不確定度的評定

3.1 樣品稱樣量引入的不確定度

3.2 測試過程中由定容體積所帶入的不確定度

合并以上兩部分所引入的不確定度，得到由體積引入的相對標準不確定度為：

3.3 液質(zhì)聯(lián)用儀儀器檢測時引入的不確定度

根據(jù)校準證書提供：U=3%，k=2，則儀器引入的標準不確定度為：Urel（E）=3%/2=0.015 0。

3.4 樣品前處理引入的不確定度

由于目標物質(zhì)磺胺多辛不可能從樣品基質(zhì)中完全提取出來，加上濃縮和純化過程的損失導致了前處理過程的不確定度較大，樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度應(yīng)用在空白豬肉樣品中添加目標物磺胺多辛后計算其回收率的方式來進行評定，對6次添加質(zhì)量濃度均為70 g/L的最終上機液進行測定，其回收率分別為：90.5%、96.2%、88.7%、89.2%、92.7%和87.5%，則目標組分磺胺多辛的平均回收率（R） 為90.8%，其標準偏差（S） 為3.18%，則由樣品前處理引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為U（R） =S=0.031 8；Urel（R）=U（R）/R=0.035 0。

3.5 測試過程隨機效應(yīng)引入的不確定度

對同個一樣品按照方法的要求重復(fù)進行10次平行有效試驗測定, 對樣品的均勻性、試劑的濃度和純度、天平的重復(fù)性、容量瓶移液槍等體積刻度的重復(fù)性等因素引入的不確定度進行計算和評定。經(jīng)測試后樣品中磺胺多辛的含量分別為：34.25 μg/kg、36.38 μg/kg、33.52 μg/kg、36.85 μg/kg、 37.05 μg/kg、 34.52 μg/kg、35.57 μg/kg、 36.92 μg/kg、 33.09 μg/kg、35.52μg/kg，10次測定的平均值為：w=35.37μg/kg，根據(jù)貝塞爾公式計算所得10次試驗的標準偏差為：1.456 6 μg/kg，則A類標準不確定度為U（w）=1.456 6/=0.467 4；A類相對標準不確定度為Urel（w）=U（w）/w=0.467 4/35.37=0.013 2。

3.6 標準溶液配制過程引入的不確定度

在本試驗中首先需要配制一個質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的磺胺多辛儲備溶液，將此溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的標準溶液，再將其適當稀釋后配置成一系列質(zhì)量濃度為 5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L 和 200 μg/L 的標準工作溶液來對樣品中的目標物進行定量，在標準溶液配制的過程中會引入較多的不確定度。

故在配制磺胺多辛標準儲備液的操作過程中所帶入的綜合相對標準不確定度可計算為：

在配制質(zhì)量濃度為1 ug/mL磺胺多辛標液的過程中所引入的相對標準不確定度為：

質(zhì)量濃度為5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、100 μg/L和200 μg/L的標準工作溶液配制方法是：用1 mL移液器吸各取1 mL質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標準溶液于體積分別為200 mL、100 mL、50 mL、25 mL、10 mL和5 mL的A級容量瓶中，并用乙腈定容至刻度。以上6只容量瓶的容量允差分別為0.15 mL、0.10 mL、0.05 mL、0.03 mL、0.02 mL 和0.02mL，按照上述計算和評定方法，可計算出各個濃度梯度的標準溶液的相對標準不確定度分別為：0.00 582、0.00 583、0.00 583、0.00 584、0.00 591和0.00 624。綜合判定時采用由質(zhì)量濃度梯度為200 μg/L的標準溶液所引入最大相對不確定度值0.00624，故本步操作的相對不確定度為Urel（S4）=0.0062。

標準溶液配制過程中溫度的變化會引入不確定度，乙腈體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，實驗室的溫度為20℃，變化范圍為5℃，由溫度波動引起的10 mL容量瓶中乙腈溶液的體積偏差為10 mL×5℃×1.37×10-3/℃=0.0 685 mL，采用矩形分布進行分析和判定，則由實驗室的溫度波動所引入的標準不確定度為：U（T1）=0.0685/=0.0395mL；其相對不確定度可計算為：Urel（T1）=0.0 395/10=0.0 040。標準溶液配制過程中依次用到了10 mL、1 L和200 mL（選取在最后一步配制過程中引入不確定度最大的一只容量瓶進行計算）3種容量瓶，其相對不確定度均為0.0040。則因溫度效應(yīng)引入的相對標準不確定度為：

3.7 合成不確定度和擴展不確定度及測量結(jié)果的報告

相對擴展不確定度可由合成相對標準不確定度乘以包含因子求得，在95%置信水平下，k=2時，其相對擴展不確定度為：

U=k×Urel×100%=8.58%。

由試驗計算得試樣中磺胺多辛含量為35.37μg/kg，其擴展不確定度為：

U擴=ρU=35.37μg/kg×0.0858=3.03μg/kg。

磺胺多辛含量測定結(jié)果表示為：

w=（35.37±3.03）μg/kg，k=2。

4 結(jié)語

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉中磺胺多辛的測試步驟比較復(fù)雜，測試中的不確定因素較多。從各個不確定度分量的評估結(jié)果來看，樣品的前處理、液質(zhì)聯(lián)用儀的工作狀況和測試過程的隨機效應(yīng)所引入的不確定度對合成不確定度的貢獻較大。檢測人員應(yīng)充分了解影響測定結(jié)果不確定度的因素，對關(guān)鍵測試環(huán)節(jié)要引起重視，盡可能的減少各種影響檢測結(jié)果不確定度的因素。在樣品測試時尤其是前處理過程中要嚴格按照方法的要求進行規(guī)范操作，以減少由于樣品處理和測試過程的隨機效應(yīng)所引入的不確定度，檢測人員還應(yīng)對測試儀器進行定期檢查維護以確保儀器正常穩(wěn)定的運轉(zhuǎn)。

［1］ 中國計量科學研究院.JJF 1059-1999測量不確定度評定與表示［S］.北京：中國計量出版社，1999：1-27.

［2］ 中華人民共和國山東出入境檢驗檢疫局，中華人民共和國吉林出入境檢疫局，中國檢驗檢疫科學研究院.GB/T 21316-2007動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法［S］.北京：中國標準出版社，2008：1-17.

［3］ 中國計量科學研究院.JJG 646-2006移液器檢定規(guī)程［S］.北京：中國計量出版社，2007：1-13.

［4］ 中國計量科學研究院.JJG 700-1999微量注射器的標準［S］.北京：中國計量出版社，1999：1 536-1 537.

［5］ 國家標準物質(zhì)研究中心.GB 12806-1991實驗室玻璃儀器單標線容量瓶［S］.北京：中國標準出版社，2001：1-12.

Evaluation of uncertainty of sulfadoxine in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry

ZHANG Hou-sen*WU Xiao-jingWANG WeiFANG Wen-juan
（Jiangsu province physics and chemistry testing center，Jiangsu province nutrients and toxic testing center，Nanjing 210042，China）

Uncertainties from the test results of sulfadoxine in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry were analyzed and assessed.The relative expended uncertainty calculated from the experimental date was 8.58%，when the designed incredible probability was 95%（k=2）.The expended uncertainty was 3.03 g/kg，while the content of sulfadoxine in the sample was 35.37 g/kg.The contribution of the uncertainty introduced by the sample pretreatment was the largest part to the combined uncertainty.

uncertainty；liquid chromatography tandem mass spectrometry；sulfadoxine；pork

TS207.5+1

A

1673-6004（2012）03-0055-04

*張厚森，男，1978年出生，2005年畢業(yè)于江蘇大學農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工工程專業(yè)，工程師

2012-07-01

2012-07-08