不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌細(xì)胞ATP敏感性鉀通道表達(dá)的影響

彭峰林 ，張 林 ，郭艷菊 ，莫偉彬 ，廖慧萍

不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌細(xì)胞ATP敏感性鉀通道表達(dá)的影響

彭峰林1，2，張 林3，郭艷菊1，莫偉彬1，廖慧萍1

目的：探討不同強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌ATP敏感性鉀通道表達(dá)的影響。方法：40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、大強(qiáng)度組、中強(qiáng)度組和小強(qiáng)度組。建立大鼠運(yùn)動(dòng)模型，采用RT-PCR技術(shù)與Western blot技術(shù)，檢測(cè)大鼠心肌KATP各亞基的表達(dá)。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示，大強(qiáng)度組和中等強(qiáng)度組Kir6.1的基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組；大強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組及小強(qiáng)度組Kir6.2的基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組；大強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組及小強(qiáng)度組SUR2的基因表達(dá)均顯著高于對(duì)照組；在大鼠心肌組織中未能檢測(cè)到SUR1的基因表達(dá)。Western blot結(jié)果與PCR結(jié)果基本相同，但小強(qiáng)度組Kir6.1蛋白表達(dá)也明顯高于對(duì)照組。結(jié)論：各種強(qiáng)度的長(zhǎng)期耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加KATP的表達(dá)。

耐力運(yùn)動(dòng)；大鼠；心肌細(xì)胞；ATP敏感性鉀通道；基因表達(dá)；蛋白表達(dá)

ATP敏感性鉀通道（ATP sensitive potassium Channel，KATP）是由Noma于1983年利用膜片鉗技術(shù)在豚鼠心室肌上首先發(fā)現(xiàn)的[1]，隨后證實(shí)KATP在缺血再灌注過(guò)程中對(duì)心肌具有保護(hù)作用。KATP包括肌膜KATP通道（sarc－KATP）和線粒體KATP通道（mito－KATP），sarc－KATP存在于細(xì)胞膜上，由內(nèi)向整流鉀通道（Kir）和磺酰脲受體（SUR）組成。mito－KATP存在于線粒體內(nèi)膜，但 mito－KATP的結(jié)構(gòu)尚未完全清楚。目前已克隆兩個(gè)內(nèi)向整流亞單位Kir6．1、Kri6．2和三個(gè)磺脲類亞單位SUR1、SUR2A和SUR2B。在短時(shí)間缺血時(shí)sarc－KATP開放可引起心臟保護(hù)效應(yīng)[2]，mito－KATP可能是缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）的終末效應(yīng)器[3]。為了探索不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌細(xì)胞KATP表達(dá)產(chǎn)生的影響，本研究設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)方案，從基因表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)不同強(qiáng)度耐力訓(xùn)練對(duì)大鼠心肌KATP亞基表達(dá)的影響，與以往研究不同處在于，本研究既設(shè)計(jì)了不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案，同時(shí)檢測(cè)了KATP各亞基的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)變化，這將為進(jìn)一步探索KATP在心肌運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性變化中的作用和機(jī)理提供充實(shí)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

11周齡Sprague－Dawley雄性大鼠40只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限任公司提供），隨機(jī)分為大、中、小3個(gè)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷組和對(duì)照組。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物房維持在溫度（22±2）℃，濕度 60%±%5，每日照明12 h，自由進(jìn)食飲水，喂養(yǎng)飼料采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料，大鼠自由飲水進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 訓(xùn)練方法 跑臺(tái)訓(xùn)練8周，第1周為適應(yīng)性訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6天，每天訓(xùn)練60 min。依據(jù)Bedford[4]的研究結(jié)果制定運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，大強(qiáng)度組：坡度 10°，速度 26．8 m/min，相當(dāng)于最大耗氧量92．3%±2．8%；中等強(qiáng)度：坡度 5°，速度 15．2m/min，相當(dāng)于最大耗氧量 64．0%±4．5%；小強(qiáng)度組：坡度 0°，速度 8．2m/min，相當(dāng)于最大耗氧量52．9%±3．1%。對(duì)照組不做任何訓(xùn)練，常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。在末次訓(xùn)練結(jié)束后24 h進(jìn)行動(dòng)物急性處理，采樣并測(cè)試。1.2.2 心肌組織KATP基因表達(dá)的測(cè)定 心尖部位無(wú)菌操作取100 mg心肌，Trizol試劑盒提取心肌總RNA，操作方法同試劑盒（RNAisoTM Plus，Takara）說(shuō)明書，將提取出的RNA于－20℃保存。測(cè)OD值計(jì)算RNA含量，RNA電泳，紫外燈下可顯示清晰的28S、18S兩個(gè)條帶，5S條帶亦可見。

PT－PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。貯存于4℃。

引物（由金思特南京科技有限公司合成），dsGAPDH（432 bp）：上游引物為 5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′；下游引物為 5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′。Kir 6．1（209 bp）：上游引 物 為 5′GAGTGAACTGTCGCACCAGA3′； 下 游 引 物 為 5′CGATCACCAGAACTCAGCAA3′。Kir6．2（167 bp）：上游引物為 5′TCCAACAGCCCGCTCTAC3′；下游引物為 5′GATGGGGACAAAA CGCTG3′。SUR1（210bp）：上游引物為 5′GGAGCAATCCAGACC AAGAT3′；下游引物為 5′Reverse：AGCCAGCAGAATGATGACA G 3′。SUR2（231 bp）：上游引物為 5′ACACGCTCCGCTCTAGAC TG3′；下游引物為 5′GCCAGGCAGAACAGCTGTCT3′。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。應(yīng)用1．2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，電泳后使用βandScan4．0軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行光密度分析，所得數(shù)值與相應(yīng)β－actin光密度的比值即為mRNA的相對(duì)含量。

1.2.3 心肌組織KATP蛋白表達(dá)的測(cè)定 制備樣品蛋白：取新鮮心肌標(biāo)本以生理鹽水充分沖洗，置液氮速凍后－80℃保存。把組織剪切成細(xì)小的碎片，裂解液裂解，冰上勻漿，至充分裂解。離心，取上清－20℃保存。

電泳：安裝電泳槽，配制15%SDS－PAGE分離膠，灌膠，封膠。配制5%的濃縮膠，灌膠，上梳，填滿空隙，放置30 min，去離子水洗滌。放入電泳槽，倒入電泳緩沖液，加樣品，樣品在沸水中煮沸，每井10 μL。80 V 20 min后調(diào)至120 V電泳1 h左右，至溴酚藍(lán)跑出膠板。染色4 h，脫色5 h。

免疫印跡：將凝膠移至盛有水的平皿中，浸洗3次，轉(zhuǎn)移至電泳緩沖液中，室溫浸泡3 h。準(zhǔn)備NC膜，濾紙，NC光面向上，凝膠置于其上，放入電轉(zhuǎn)移槽。14V，100 mA，轉(zhuǎn)印2 h。封閉過(guò)夜。NC 置于單克隆抗體 mouse－anti－Kir6．1/Kir6．2/SUR2（1：300）液中，緩搖2 h。PBS/T洗膜3次，每次15 min，將NC置于1：2000 稀釋的 goat－anti－mouse IgG，室溫緩搖 2 h。PBS/T 洗膜 3次，每次10 min，將NC置于DAB底物中反應(yīng)著色拍照。

結(jié)果半定量：以 β－actin 代替 mouse－anti－Kir6．1/Kir6．2/SUR2重復(fù)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，在底片上得到內(nèi)參β－actin的條帶。圖像分析系統(tǒng)掃描條帶灰度值，用底片上mouse－anti－Kir6．1/Kir6．2/SUR2條帶的灰度值與內(nèi)參β－actin條帶的恢度值的比值半定量分析的 Kir6．1/Kir6．2/SUR2 表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示。采用單因素方差分析及多重比較，以 P＜0．05為有顯著性差異，以P＜0．01為有非常顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)KATP亞基在轉(zhuǎn)錄水平的影響

RT－PCR后比較KATP各亞基與GAPDH基因表達(dá)的比值，大強(qiáng)度組和中等強(qiáng)度組的Kir6．1的基因表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0．01）；大強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組及小強(qiáng)度組的Kir6．2的基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0．05 或 P＜0．01）；大強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組及小強(qiáng)度組的SUR2的基因表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P＜0．05或P＜0．01）；在大鼠心肌組織中未能檢測(cè)到SUR1的基因表達(dá)（見圖1）。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞KATP亞基基因表達(dá)（GAPDH為內(nèi)參），Hig：大強(qiáng)度組；Mid：中強(qiáng)度組；Low：小強(qiáng)度組；Con：對(duì)照組Fig.1 Relative expression levels of KATP subunits Kir6.1，Kir6.2 and SUR2 mRNA in myocardial cells in different groups.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，vs control group.

2.2 耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)KATP亞基在翻譯水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)蛋白電泳結(jié)果見圖2，比較KATP各亞基與β－actin條帶的灰度比值，發(fā)現(xiàn)小強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組和大強(qiáng)度組 Kir6．1 的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P＜0．05）；大強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組及小強(qiáng)度組Kir6．2的蛋白表達(dá)非常顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）；大強(qiáng)度組、中等強(qiáng)度組及小強(qiáng)度組SUR2的基因表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P＜0．05 或 P＜0．01），以中等強(qiáng)度組 SUR2 表達(dá)值最高。

3 分析與討論

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞KATP亞基蛋白表達(dá)。Hig：大強(qiáng)度組；Mid：中強(qiáng)度組；Low：小強(qiáng)度組；Con：對(duì)照組Fig 2 The expression of KATP subunits protein in different groups rat myocardial cells.

KATP屬于內(nèi)向整流鉀通道超家族的一種，通道的開閉直接受到胞內(nèi)[ATPi]/[ADPi]的影響，被認(rèn)為是一種與細(xì)胞代謝狀態(tài)密切相關(guān)的配體門控型離子通道。KATP最早發(fā)現(xiàn)于心肌細(xì)胞[1]，隨后又陸續(xù)在平滑肌細(xì)胞、胰腺p細(xì)胞等外周細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了KATP的表達(dá)。研究表明：KATP是由Kir和ATP結(jié)合蛋白按1∶1組成的四聚體，而組成KATP的Kir和SUR具有組織特異性。在不同組織，KATP的表達(dá)呈現(xiàn)多樣性，已有報(bào)道證實(shí)在心肌、胰腺表達(dá)的KATP亞型結(jié)構(gòu)各不相同，并且通過(guò)藥理學(xué)、生物物理學(xué)手段檢測(cè)出的功能也不盡相同。現(xiàn)在認(rèn)為胰腺β細(xì)胞和大腦神經(jīng)細(xì)胞KATP由kir6.2和SUR1組成，心肌和骨骼肌KATP由kir6.2和SUR2A組成，腎臟KATP由kir1.1和CFTR組成，平滑肌KATP為Kir6.2和SUR2B組成[5~7]。KATP不僅存在于細(xì)胞膜上，也存在于線粒體膜上。1991年，INOUE在大鼠肝線粒體內(nèi)膜記錄到KATP的存在，雖然mito-KATP通道亞基組成已有幾個(gè)研究小組進(jìn)行了深入研究，但此通道的分子結(jié)構(gòu)仍存在爭(zhēng)議。SUZUKI等1997年報(bào)道大鼠心肌mito-KATP含有Kir6.1[8]。2003年LACZA和SINGH的研究小組報(bào)道大鼠和小鼠心肌線粒體中有Kir6.1和Kir6.2亞基的表達(dá)[9，10]，另有研究報(bào)道，Kir6.1和Kir6.2都不是家兔和小鼠心肌細(xì)胞mito-KATP通道的組成部分[11-12]。至于磺脲類受體（SUR）亞基，2003年SINGH[10]在大鼠心肌中檢測(cè)到SUR2A，但LACZA等[12]在小鼠心肌細(xì)胞線粒體中既沒(méi)發(fā)現(xiàn)SUR1也沒(méi)發(fā)現(xiàn)SUR2，表明mito-KATP不僅有組織特異性，還有種屬特異性。DANG VAN CUONG等[13]采用熒光檢測(cè)技術(shù)和Western blot分析方法研究了大鼠心肌細(xì)胞mito-KATP的分子組成，認(rèn)為mito-KATP通道亞單位包括Kir6.1、Kir6.2和SUR2，不包含SUR1?；趍ito-KATP分子組成尚沒(méi)有形成統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，所以本研究采用RTPCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)分別在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)KATP四個(gè)亞基在大鼠心肌中的表達(dá)，首次探索不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)KATP各亞基表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果顯示：無(wú)論是轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平，均出現(xiàn)了Kir6.1、Kir6.2、SUR2的表達(dá)，但沒(méi)有檢測(cè)到SUR1的表達(dá)，表明大鼠心肌細(xì)胞KATP通道的亞單位為Kir6.1、Kir6.2、SUR2。結(jié)果證實(shí)了Dang Van Cuong等[13]的研究結(jié)論。另外研究發(fā)現(xiàn)：高、中、低強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均可以促進(jìn)大鼠心室肌Kir6.1、Kir6.2、SUR2的表達(dá)。有研究報(bào)道過(guò)一次性反復(fù)力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠心肌Kir6.1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示兩種運(yùn)動(dòng)情形下，心室肌Kir6.1的表達(dá)均顯著增加[14]，而運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌KATP另兩個(gè)亞基表達(dá)的影響的研究少見報(bào)道，更沒(méi)有系統(tǒng)研究不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)KATP表達(dá)影響的差異，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練提高心室肌KATP亞基表達(dá)的機(jī)理也缺乏深入研究。根據(jù)本研究的結(jié)果，并結(jié)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌細(xì)胞代謝、內(nèi)分泌及神經(jīng)調(diào)控的影響，推測(cè)運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)下列途徑影響KATP的表達(dá)：其一，長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)可以引起血糖水平的下降和肌糖原含量的下降，而能源底物濃度的降低可通過(guò)一些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制促進(jìn)KATP亞基的表達(dá)[15，16]。其二，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生明顯改變，血流動(dòng)力學(xué)的改變參與了AngⅡ表達(dá)的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ參與了KATP通道亞基表達(dá)的調(diào)節(jié)。AngⅡ是RAS中的一個(gè)組成成分，局部RAS調(diào)節(jié)了KATP亞基的表達(dá)[17]。其三，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中應(yīng)激激素水平的升高，會(huì)通過(guò)多條途徑誘導(dǎo)KATP表達(dá)的增加[18]。其四，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中心肌的相對(duì)缺血或絕對(duì)缺血會(huì)誘導(dǎo)KATP表達(dá)的增加[19]。

心肌KATP在正常生理情況下并不開放，當(dāng)心肌缺血、缺氧、能量匱乏時(shí)，KATP開放以保護(hù)心肌。KATP通道的凈活力是由細(xì)胞內(nèi)的KATP通道數(shù)量和開放程度決定的，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)心肌細(xì)胞Kir6.1、Kir6.2和SUR2表達(dá)的增加，表明KATP通道表達(dá)增加，KATP活力增加，這對(duì)于提高心肌的抗缺血再灌注損傷具有重要意義[20]。KATP可能通過(guò)如下機(jī)制介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)。（1）.減輕再灌注Ca2+超載，sarc-KATP通道開放導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，電壓依賴性慢Ca2+通道關(guān)閉，Ca2+內(nèi)流減少[21]。另外sarc-KATP通道開放致K+外流，復(fù)極加速，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，平臺(tái)期內(nèi)流Ca2+減少，Na+-Ca2+交換加強(qiáng)而排出胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+。激活mito-KATP通道，進(jìn)而激活 Na+／K+ATPase，減少 Na+內(nèi)流和[Na+]i，減少 Na+-Ca2+交換，也能達(dá)到心肌保護(hù)的目的[22]。（2）減少心肌能量消耗。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平降低，致缺血心肌電機(jī)械活動(dòng)抑制，心肌收縮力減弱，從而減少ATP的消耗[23]。（3）減少氧自由基的損傷，KATP通道可使缺血心肌的過(guò)氧化物釋放減少[24]。有研究認(rèn)為，mito-KATP通道在抗自由基方面可能有一個(gè)獨(dú)立的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[25-26]。（4）抑制心肌細(xì)胞凋亡。mito-KATP通道可通過(guò)影響一些凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制達(dá)到抗凋亡的目的。mito-KATP開放，降低caspase-3及bax水平，抑制caspase-3的活化[27]?？傊?，不同強(qiáng)度的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能不同程度引起KATP表達(dá)的增加，提高KATP的活性，從而有利于對(duì)抗缺血再灌注損傷，但不同運(yùn)動(dòng)引起的心臟保護(hù)作用不一定完全相同，而且KATP在介導(dǎo)不同運(yùn)動(dòng)心臟保護(hù)作用的機(jī)制也可能不相同，這些尚需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Different Intensity Endurance Exercise Training on the Expression of ATP-sensitive Potassium Channel in Rat’s Cardiomyocytes

PENG Fenglin1，2，ZHANG Lin3，GUO Yanju1，MO Weibin1，LIAO Huiping1
（1．School of PE，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China；2．The Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources，Guilin 541004，China；3．School of PE，Suzhou University，Suzhou 215006，China）

Objective∶To explore the effects of different intensity endurance exercise training on the expression of ATP sensitive potassium Channel（KATP）in cardiomyocytes of rats．Methods∶40 male SD rats were randomly divided into control group （n=10），high－intensity group （n=10），moderate－intensity group（n=10）and low－intensity group（n=10）．To establish the running exercise models in rats，and detect the changes of the expression of KATP in control group and in the other three exercise groups after training by using the method of RT－PCR and Western blot．Results∶RT－PCR results showed that the gene expression of Kir6．1 in high－intensity group and the moderate－intensity group was significantly higher than control group．The gene expression of Kir6．2 in high－intensity group，the moderate－intensity group and low－intensity group was significantly higher than control group．The gene expression of SUR2 in high－intensity group，the moderate－intensity group and low－intensity group was significantly higher than control group．The gene expression of SUR1 was failed to detect in rat's cardiomyocytes．Western blot analysis was as same as PCR results，but Kir6．1 protein expression in low－intensity group was significantly higher than control group．Conclusions∶After long－time training，all intensity endurance running can increase the expression of KATP．

endurance exercise；rats；cardiomyocytes；ATP sensitive potassium channel；gene expression；protein expression

G 804．8

A

1005-0000（2012）02-093-04

2011-12-02；

2012-02-10；錄用日期：2012-02-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：31060146）；藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助課題（項(xiàng)目編號(hào)：CMEMR2011-02）

彭峰林（1969-），男，湖南雙峰人，教授，博士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)適應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制。

1.廣西師范大學(xué)體育學(xué)院，廣西桂林541004；2.藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004；3.蘇州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇蘇州215006。