響應(yīng)面法優(yōu)化禿瘡花中生物堿提取工藝及抑菌活性研究

趙強(qiáng)，余四九，王廷璞，袁毅君

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水741001）

禿瘡花（Dicranostigmaleptopodum）又名紅茂草、禿子花、勒馬回，為罌粟科禿瘡花屬草本植物。生于海拔1 300m以上的高原、山坡、丘陵、路旁等處。在甘肅省隴南、天水、平?jīng)龅鹊氐奈妓饔?、秦嶺南北均有廣泛的分布。該植株味苦、澀，性涼，可入藥，有抗炎、抑菌、消腫止痛、清熱解毒等功效［1］。研究表明，由于禿瘡花含有多種異喹啉類生物堿，所以其表現(xiàn)出具有多種生物學(xué)活性［2］。將該生物堿臨床用于結(jié)核病和竇道潰瘍癥，其總有效率可達(dá)90%以上，還具有提高心肌細(xì)胞功能、提高機(jī)體免疫力、保護(hù)受損肝細(xì)胞、抗溶血等藥理學(xué)活性，且安全無(wú)毒副作用［3－6］。

近年來(lái)，學(xué)者對(duì)禿瘡花的研究日漸深入。陳荃等［7］采取石蠟切片法和光學(xué)顯微鏡技術(shù)，對(duì)禿瘡花營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，進(jìn)一步了解了其微觀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為該植物的人工馴化和科學(xué)栽培提供了基礎(chǔ)依據(jù)；趙強(qiáng)等［8］、王廷璞等［9］先后利用指紋識(shí)別和波層色譜檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)禿瘡花中含有5種主要生物堿成分，其中異紫堇堿含量較高；董曉寧等［10］、趙強(qiáng)等［8］將禿瘡花經(jīng)石英色譜柱層析的提取物，作用于大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)其具有一定的抑菌效果，其對(duì)超氧自由基和羥基自由基也有一定的清除作用；劉大護(hù)等［11］利用普通硅膠柱色譜對(duì)禿瘡花的生物堿類化學(xué)成分進(jìn)行提取、分離和純化，并利用超導(dǎo)核磁共振等現(xiàn)代光譜和波譜技術(shù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，從禿瘡花中發(fā)現(xiàn)11個(gè)異喹啉類生物堿，其中2個(gè)萘菲啶類、1個(gè)嗎啡烷類、4個(gè)阿撲菲類和4個(gè)普羅托品類生物堿化合物；鞏江等［12］對(duì)珍稀中藥禿瘡花進(jìn)行了藥學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)禿瘡花的生物堿在抗菌、抗腫瘤、肝保護(hù)等方面有很強(qiáng)的藥學(xué)活性，其具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景；趙強(qiáng)等［13］采用酸性染料比色法，以異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)禿瘡花中總生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定，從而建立了禿瘡花中總生物堿含量的檢測(cè)方法，為該藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)；李巖等［14］利用國(guó)際通用DNA條形碼技術(shù)，對(duì)新疆伊犁地區(qū)禿瘡花基因條形碼及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了初步研究，測(cè)序獲得的rbcL和matK基因序列長(zhǎng)度分別為539和700bp，用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建了基于rbcL和matK序列的系統(tǒng)樹(shù)，發(fā)現(xiàn)伊犁禿瘡花聚在罌粟亞科中，與荷青花屬（Hylomecon）、金罌粟屬（Stylophorum）、海罌粟屬（Glaucium）親緣關(guān)系較近；朱榮［15］對(duì)禿瘡花在Zn、Cd、Cu和Pb脅迫下的耐性和富集特征做了研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)Cd和Zn具有較強(qiáng)的耐性和富集能力，對(duì)Cu和Pb具有較弱的耐性和富集能力。

本試驗(yàn)于2011年5月開(kāi)始，采用禿瘡花中的主要生物堿異紫堇堿做為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)6組單因素試驗(yàn)篩選出主要影響因素，再進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從而優(yōu)選建立了禿瘡花生物堿最佳提取工藝條件，并將其提取濃縮液作用于3種常見(jiàn)供試菌，研究其體外抑菌活性能力大小，為該植物資源的深層次開(kāi)發(fā)和利用提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 RE52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（亞榮生化儀器廠）、UV－751GD型紫外－可見(jiàn)光分光光度計(jì)（瑞利儀器分析有限公司產(chǎn)品）、KQ－500D型數(shù)控超聲波清洗器（瑞利儀器分析有限公司產(chǎn)品）、JEM－1230型透射電子顯微鏡（瑞利儀器分析有限公司產(chǎn)品）、AB104－S電子分析天平、索氏提取器等。

1.1.2 藥物及試劑 禿瘡花于2011年4月采自天水師范學(xué)院植物園，由王廷璞研究員鑒定。經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎，過(guò)80目篩（0.178mm）。異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma化學(xué)公司）、磷酸（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）、95%乙醇（開(kāi)封化學(xué)試劑總廠）、戊二醛（金山化工廠）等。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，pH＝7.4。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，蒸餾水1 000mL，瓊脂20g，pH＝7.4。

1.1.4 試驗(yàn)菌種 大腸埃希氏桿菌（Escherichiacoli，ATCC 12453）、白色念珠菌（Candidaalbicans，ATCC 10231）、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa，ATCC 27853）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 禿瘡花生物堿定性預(yù)試驗(yàn) 稱取禿瘡花干草粉末10.0g，裝入索氏提取器中，水浴加熱回流3h，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓蒸至無(wú)醇味，趁熱加入少許活性炭，封口、靜置、過(guò)夜。分別進(jìn)行碘化鉍鉀、硅鎢酸、苦味酸試驗(yàn)，均呈明顯的陽(yáng)性反應(yīng)，表明樣品中含有生物堿成分。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 準(zhǔn)確配制0.5mg／mL異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液100mL，依次量取1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11mL，分別置于100mL容量瓶中，加無(wú)離子水稀釋至100mL，搖勻，使之為5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55μg／mL的梯度溶液，以三重蒸餾水為空白，選取OD210值進(jìn)行測(cè)定。以濃度C（μg／mL）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 禿瘡花生物堿的提取工藝 稱取禿瘡花干草粉末7份，每份10.0g。固定液料比14mL／g、浸泡時(shí)間18h、回流時(shí)間2.5h、超聲時(shí)間25min、浸提液pH＝5，考察乙醇濃度為60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%時(shí)對(duì)提取效果的影響。然后將優(yōu)選的最佳乙醇濃度做為固定數(shù)值，依次選取考察液料比為12∶1，13∶1，14∶1，15∶1，16∶1mL／g，乙醇浸泡時(shí)間為0，6，12，18，24，30h，索氏提取器中回流時(shí)間為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5h，超聲波振蕩時(shí)間為15，20，25，30，35min，乙醇浸提液pH 值為2，3，4，5，6，7，8時(shí)對(duì)提取效果的影響。將每次優(yōu)選后的最佳條件固定，再逐次篩選其余最佳條件。根據(jù)單因素水平試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行極差分析，最終優(yōu)選出4個(gè)主要影響因素，按照響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行生物堿提取。再將提取液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，35℃下減壓蒸至無(wú)醇味，轉(zhuǎn)入100mL錐形瓶，封口靜置。

1.2.4 禿瘡花生物堿含量的測(cè)定 將25個(gè)50mL容量瓶中的提取液稀釋后測(cè)定其吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出提取液中生物堿的濃度，最后計(jì)算出禿瘡花中生物堿提取得率。

1.2.5 響應(yīng)面法對(duì)禿瘡花中生物堿提取條件的優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Box－Behnken中心設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行禿瘡花中生物堿提取條件的優(yōu)化。

1.2.6 體外抑菌 1）菌液制備：將所選供試菌事先接種于無(wú)菌平板上，37℃培養(yǎng)1d后，選取典型菌落，轉(zhuǎn)移接種在液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)1d后，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋，使其為菌量106～107CFU／mL的菌懸液，備用。2）培養(yǎng)基的配制：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確稱取牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 5g放入燒杯中，加入蒸餾水1 000mL，調(diào)pH＝7.4，即得牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基1 000mL，同法另加瓊脂20g，即為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基1 000mL。將配制好的培養(yǎng)基及若干包裝好的試管、燒杯、涂布棒、移液管及若干培養(yǎng)皿于高壓滅菌鍋中，120℃下濕熱滅菌30min，置于37℃培養(yǎng)箱中備用。

3）最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定：將禿瘡花提取濃縮液用無(wú)菌蒸餾水倍比稀釋，制備所需系列濃度的稀釋液。然后將稀釋液分別定量轉(zhuǎn)移至無(wú)菌培養(yǎng)皿中，與定量倒入的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基充分混勻，室溫冷卻、凝固，制成含藥液的平板［16－19］。再按培養(yǎng)皿所需的劑量，分別移取定量被試菌液，涂于平板上，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)1～2d，檢查菌落生長(zhǎng)情況，以平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，另取各含藥液1∶5濃度無(wú)菌陰性和無(wú)藥陽(yáng)性作為對(duì)照。以肉眼計(jì)數(shù)，完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)時(shí)的最低生物堿濃度，為該藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）［16－19］。取上述MIC及以上各濃度未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各試管培養(yǎng)物，分別移取0.1mL接種至不含生物堿的培養(yǎng)基上，涂勻平板，置于恒溫箱37℃培養(yǎng)1d，查看有無(wú)菌落生長(zhǎng)，計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者，為該藥物的最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）。以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

4）透射電子顯微鏡觀察：選取典型供試菌（大腸埃希氏桿菌）作為研究對(duì)象，將其接種在已制得的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫箱37℃培養(yǎng)1d后，用pH＝6.0的5mmol／L磷酸緩沖液洗脫細(xì)菌，使其含量保持在108CFU／mL左右。移取500μL菌懸液，加到濃度為0.2%的禿瘡花提取濃縮液中（溶于1% 醋酸），使禿瘡花提取濃縮液最終濃度稀釋為0.1%。將其置于1.5mL離心管中，37℃搖床（120r／min）培養(yǎng)1d，離心后取出細(xì)菌沉渣。將離心后的細(xì)菌團(tuán)，加3%戊二醛，在4℃時(shí)固定5h，用5mol／L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次10min，再用1%的OsO44℃后固定1h，最后用5mol／L磷酸鹽緩沖液漂洗3次。使用40%，60%，80%，100%乙醇，4℃下脫水10min，再用純丙酮脫水2次，每次10min。加入環(huán)氧樹(shù)脂Epon－812（1∶1）與純丙酮，室溫靜置3h，用環(huán)氧樹(shù)脂Epon－812包埋后，分別在30，40，60℃下，聚合4，12，24h，制成超薄切片，使用枸椽酸鉛和醋酸雙氧鈾雙染色，在JEM－1230型透射電鏡下觀察其抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 禿瘡花生物堿含量的測(cè)定

根據(jù)異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度梯度在OD210的吸光值，得回歸方程：y＝0.011 0x＋0.065 2，R2＝0.998 9（n＝11），其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1所示，在5～55 μg／mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 異紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of isocorydine

2.2 禿瘡花生物堿單因素提取試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 隨著乙醇濃度的變化，在65%時(shí)生物堿含量最大；隨著乙醇濃度的增大，生物堿含量依次呈明顯下降趨勢(shì)，此時(shí)乙醇濃度對(duì)提取效果的影響變得不顯著（圖2）。主要是因?yàn)橐掖紳舛容^大時(shí)，會(huì)將樣品中的油脂和糖類等物質(zhì)提取出來(lái)，不利于生物堿的提?。灰掖紳舛容^小時(shí)，生物堿在其中的溶解度也較小。故選取適宜生物堿提取的乙醇濃度為65%。

2.2.2 液料比對(duì)提取效果的影響 隨著液料比的增加，生物堿的含量也隨之增大；當(dāng)液料比為15∶1時(shí)生物堿含量達(dá)到最大值（圖3），其后開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，主要是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)溶劑用量的增加，有助于生物堿的浸出。故選取適宜生物堿提取的液料比為15∶1。

2.2.3 浸泡時(shí)間對(duì)提取效果的影響 65%乙醇浸泡時(shí)間在6～10h時(shí)，生物堿含量達(dá)到最大峰值（圖4）；當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)12h后，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，生物堿含量迅速降低。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使其他化合物溶出，不利于生物堿的提取，長(zhǎng)時(shí)間浸泡也使得提取周期變長(zhǎng)，不利于提取工藝模式的建立。故選取適宜生物堿提取的浸泡時(shí)間為8h。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction effect

圖3 液料比對(duì)提取效果的影響Fig.3 The effect of liquid to solid ratio on the extraction effect

2.2.4 回流時(shí)間對(duì)提取效果的影響 當(dāng)在索氏提取器中回流時(shí)間為2.5h時(shí)，生物堿含量呈明顯單一峰值（圖5），此時(shí)再進(jìn)行提取，會(huì)發(fā)現(xiàn)索氏提取器中的溶液顏色逐漸變淺，說(shuō)明被提取物已經(jīng)大部分被提取。故選取適宜生物堿提取的回流時(shí)間為2.5h。

2.2.5 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響 超聲波振蕩時(shí)間在15～30min時(shí)，生物堿含量隨時(shí)間的增加而增大，并達(dá)到最大峰值（圖6）；當(dāng)時(shí)間超過(guò)30min后，生物堿含量隨時(shí)間增加而減小。使用超聲波可以破碎細(xì)胞，加快細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶解，但是超聲作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，又可以使部分生物堿分解。故選取適宜生物堿提取的超聲時(shí)間為30min。

2.2.6 浸提液pH值對(duì)提取效果的影響 乙醇浸提液pH值在3～6時(shí)，生物堿含量隨pH值的增加而增大，并達(dá)到最大峰值（圖7）；當(dāng)pH值超過(guò)6以后，生物堿含量隨pH值增加而減小。這是因?yàn)槎d瘡花生物堿本身堿性較弱，在弱酸性介質(zhì)中反應(yīng)變?yōu)辂}類，能使之較好的溶解。故選取適宜生物堿提取的浸提液pH＝6。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化禿瘡花中生物堿的提取條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的選擇 采用極差分析對(duì)6組單因素水平進(jìn)行篩選，最終選用液料比、超聲時(shí)間、回流時(shí)間和乙醇濃度為主要考察因素，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，使用Design－Expert 7.0軟件，以禿瘡花主要生物堿（異紫堇堿）含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平（共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)面試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值，其因素水平如表1所示［20，21］。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 The effect of macerating time on the extraction effect

圖5 回流作用時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.5 The effect of reflux time on the extraction effect

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 以A（液料比）、B（超聲時(shí)間）、C（回流時(shí)間）、D（乙醇濃度）為自變量，禿瘡花生物堿含量為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共有29個(gè)試驗(yàn)，其中24個(gè)為析因試驗(yàn)，5個(gè)為中心試驗(yàn)，用以估計(jì)誤差。29組響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2所示。對(duì)4個(gè)自變量模型，單獨(dú)存在及交互作用下的方差分析結(jié)果，見(jiàn)表3所示。

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面軟件分析，經(jīng)二次回歸擬合后，得到4個(gè)因素與禿瘡花生物堿含量之間的模擬方程為：

Y＝11.338 0＋0.206 6A＋0.763 3B＋0.013 1C＋0.674 2D＋0.177 6AB－0.009 5AC－0.017 0AD＋0.720 7BC＋0.243 9BD＋0.057 1CD－1.007 6A2－1.236 0B2－0.511 8C2－1.343 4D2。

該回歸模型F檢驗(yàn)為極顯著（P＜0.01），其失擬項(xiàng)在α＝0.05水平上為極顯著（P＜0.01），純誤差項(xiàng)不顯著，其決定系數(shù)r2＝0.874 3，說(shuō)明該擬合方程與實(shí)際情況相符，且誤差較小，能充分反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，其影響不是呈簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。通過(guò)該方程發(fā)現(xiàn)，各種因素之間存在著一定的交互作用，其中B、D、BC、A2、B2、C2、D2均呈極顯著影響（P＜0.01），A呈顯著影響（P＜0.05），C、AB、AC、AD、BD、CD均呈不顯著。

從單因素水平觀察，可以得出其影響順序?yàn)椋築（超聲時(shí)間）＞D（乙醇濃度）＞A（液料比）＞C（回流時(shí)間）。在有交互作用存在下，對(duì)禿瘡花生物堿含量的影響順序?yàn)椋築C＞BD＞AB＞CD＞AD＞AC。

2.3.3 響應(yīng)面分析 從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著（圖8）；曲線走勢(shì)越平滑，其影響越小。超聲時(shí)間、乙醇濃度和液料比的圖形曲線走勢(shì)較陡，說(shuō)明其影響最為顯著。由Design－Expert 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出影響禿瘡花中生物堿含量的最佳提取工藝條件為：液料比15.14 mL／g、超聲時(shí)間34.49min、回流時(shí)間2.67h、乙醇濃度66.49%、生物堿含量為11.62%，結(jié)合實(shí)際操作過(guò)程中的局限性，最終確定修正后的工藝條件為：液料比15mL／g、超聲時(shí)間35min、回流時(shí)間2.5h、乙醇濃度65%，在此工藝下禿瘡花生物堿含量為9.33%。按照優(yōu)化條件進(jìn)行平行3組提取試驗(yàn)，取平均值為9.06%，與理論值相差0.22%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件可靠。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.6 The effect of ultrasonic time on the extraction effect

圖7 浸提液pH值對(duì)提取效果的影響Fig.7 The effect of pH of extracts on the extraction effect

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 The response surface of level of factor

2.4 抑菌試驗(yàn)

按照響應(yīng)面法優(yōu)選的最佳組合提取禿瘡花生物堿，并減壓濃縮至無(wú)醇味，用無(wú)菌蒸餾水將濃縮液稀釋為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40mg／mL 8組濃度梯度，另作陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明（表4），禿瘡花提取濃縮液對(duì)大腸埃希氏桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌3種供試菌的最小抑菌濃度分別為0.20，0.15和0.35mg／mL，最低殺菌濃度分別為0.15，0.10和0.30mg／mL。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experiment result of response surface

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 The variance analysis of response surface

圖8 各因素之間的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.8 The contour map and response surface graph between the various factors

表4 禿瘡花提取濃縮液最小抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定Table 4 The concentrated liquid of the minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration extract from D.leptopodum 個(gè)No.

加入禿瘡花提取濃縮液前后，對(duì)照組（圖9A）的大腸埃希氏桿菌胞質(zhì)均勻、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁均完整，其切面呈明顯桿狀。加入禿瘡花提取濃縮液后的大腸埃希氏桿菌（圖9B），細(xì)菌外形已變?yōu)榍蛐位虿灰?guī)則型，細(xì)胞壁變薄且不完整，有些菌體細(xì)胞壁部分脫落或消失，細(xì)胞壁外觀呈毛刺狀或輪廓模糊，結(jié)構(gòu)不清晰且伴隨不同程度的凹陷變形，細(xì)胞外有溶出物溢出。

圖9 禿瘡花提取濃縮液加入前后大腸埃希氏桿菌透射電鏡圖（×50 000）Fig.9 The transmission electron microscopy images of E.coli pretreatment treated with concentrated liquid of extract from D.leptopodum （×50 000）

3 討論

使用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)，克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，而無(wú)法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，并能減少試驗(yàn)次數(shù)，分析幾種因素間的交互作用，以達(dá)到較全面地反映各因素水平的效果［20－23］。本試驗(yàn)首先考察了液料比、浸泡時(shí)間、回流時(shí)間、超聲時(shí)間、浸提液pH、乙醇濃度6組單因素水平對(duì)禿瘡花生物堿的影響，最終篩出4組主要因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定其最佳提取工藝條件為：液料比15mL／g、超聲時(shí)間35min、回流時(shí)間2.5h、乙醇濃度65%，在此條件下禿瘡花中生物堿含量為9.33%。

將禿瘡花按照響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最佳工藝進(jìn)行提取，用其濃縮液對(duì)大腸埃希氏桿菌、白色念珠菌、綠膿桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)這3種供試菌的最小抑菌濃度分別為0.20，0.15和0.35mg／mL，最低殺菌濃度分別為0.15，0.10和0.30mg／mL。以大腸埃希氏桿菌為研究對(duì)象，進(jìn)行50 000倍透射電鏡觀察，其抑菌效果顯著。

禿瘡花在甘肅省隴東南地區(qū)資源豐富，有解毒、清熱之功效。通過(guò)對(duì)禿瘡花中生物堿的響應(yīng)面提取工藝及抑菌活性研究，為其資源的進(jìn)一步深層次開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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