紫花苜蓿WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與亞細(xì)胞定位

陳婷婷，楊青川，丁旺，康俊梅，張鐵軍，張新全

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

植物生長發(fā)育受多種生物和非生物因素的影響。在長期自然選擇壓力下，植物逐漸形成由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而產(chǎn)生多種生理生化機制來感知和響應(yīng)各種外界信號［1，2］。在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子中，ERF［3］，bZIP［4］，MYB［5］，NAC［6］和 WRKY［7］家族由于其重要功能而被廣泛研究。WRKY 家族最早由Ishiguro和 Nakamura［8］在白薯（Ipomoeabatatas）中發(fā)現(xiàn)，隨后在野生燕麥（Avenafatua）［9］、荷蘭芹（Petroselinumcrispum）［10］、擬南芥 （Arabidopsisthaliana）［11］、煙 草 （Nicotianatabacum）［12－15］、馬 鈴 薯 （Solanumtuberosum）［16，17］、棉 花（Gossypiumarboreum）［18］和水稻（Oryzasativa）［19］中相繼克隆了該家族的成員。目前，小立碗蘚（Physcomitrellapatens）中發(fā)現(xiàn)37個WRKY家族成員，而在大豆（Glycinemax）中估計有超過200個該家族成員。WRKY家族成員都包含WRKY構(gòu)結(jié)域和鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)WRKY構(gòu)結(jié)域的個數(shù)以及鋅指結(jié)構(gòu)的特征可將WRKY蛋白家族成員分為三類：第Ⅰ類含有2個WRKY構(gòu)結(jié)域，第Ⅱ和第Ⅲ類含有1個WRKY構(gòu)結(jié)域，第Ⅰ類和第Ⅱ類的成員含有 C2－H2（C－X4－5－C－X22－23－H－X－H）鋅指結(jié)構(gòu)，第Ⅲ類的 C2－H2型鋅指結(jié)構(gòu)被 C2－HC（C－X7－C－X23－H－X－C）代替［20，21］。該家族成員與多種生物和非生物脅迫相關(guān)，此外還有研究表明該家族成員與植物衰老［22］，物質(zhì)代謝［23］，種子休眠［24］等相關(guān)，總之，植物體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)都有 WRKY蛋白家族成員的參與。紫花苜蓿（Medicagosativa）是一種優(yōu)質(zhì)的豆科牧草［25，26］，近年來在農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整過程中發(fā)揮越來越重要的作用。本研究利用表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）電子克隆技術(shù)結(jié)合反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）成功從苜蓿中克隆到1個 WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA序列，運用生物信息學(xué)工具對該序列編碼蛋白進(jìn)行分析；通過構(gòu)建瞬時表達(dá)載體，運用基因槍轟擊洋蔥（Allium cepa）表皮細(xì)胞的方法對該基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步驗證該基因功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

“中苜1號”紫花苜蓿由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草研究室提供。挑選干凈飽滿的種子接種于1／2Murashige and Skoog（1／2MS）培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，2周后取幼苗于液氮中速凍，－80℃保存?zhèn)溆?。實驗?010年7月－2011年3月進(jìn)行。

1.2 菌株、試劑與載體

大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5a、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物公司；克隆載體pMD19－T和M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Takara公司；Trizol試劑購自北京博邁德生物公司；瞬時表達(dá)載體pA7－GFP由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草研究室保存及提供；其他常用試劑采用進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 電子克隆 以公布的大豆WRKY56基因（GenBank登錄號：EU375348.1）為探針?biāo)阉髅绹鴩⑸锛夹g(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）的苜蓿屬EST數(shù)據(jù)庫，獲得的EST序列使用CAP3軟件（http：／／pbil.univ－lyon1.fr／cap3.php）拼接為重疊群，運用 ORF Finder軟件（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）對獲得的重疊群進(jìn)行開放閱讀框分析。

1.3.2 RT－PCR擴(kuò)增 參照Trizol試劑說明書提取苜蓿幼苗的總RNA，提取的總RNA根據(jù)M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。以獲得的cDNA第一鏈為模板，根據(jù)電子克隆獲得的序列設(shè)計正向引物P1：5′－AACTCTTTTGTCTTTGAGCTTGAAC－3′和 反 向 引 物 P2：5′－TATATATCCTAGATTACTTTGGCCC－3′進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：H2O 34.5μL、buffer 5μL、dNTP 4μL、P1和P2各2μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、模板2μL；反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30 s，53℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環(huán)后，72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶，回收產(chǎn)物連接克隆載體pMD19－T，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α，在含有氨芐青霉素的Luria－Bertani（LB）固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，菌液PCR檢測后陽性單菌落送北京華大基因公司測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 目的基因編碼蛋白的等電點和分子量預(yù)測運用瑞士生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站的Compute pI／Mw軟件（http：／／www.expasy.org／tools／pi＿tool.html）進(jìn)行；疏水性輪廓運用 Protscale軟件（http：／／expasy.org／tools／protscale.html）預(yù)測；二級結(jié)構(gòu)使用 PBIL LYON－GERLAND數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測，信號肽使用SignalP 3.0軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預(yù)測；亞細(xì)胞定位情況使用 ProtComp Version 9.0（http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml）軟件預(yù)測。用目的基因氨基酸序列利用“BlastP”程序進(jìn)行相似性比對，下載與之匹配的氨基酸序列，用Clustal X軟件進(jìn)行多重比對，用進(jìn)化樹表示目的基因編碼產(chǎn)物與已知同類蛋白質(zhì)的序列相似性。

1.3.4 克隆載體pMD－MsWRKY56構(gòu)建 根據(jù)獲得的cDNA序列設(shè)計引物P3：3′－CTCGAGATGGATTGTTCATCATATATCAAC－5′（下劃線部分為酶切位點XhoⅠ）和P4：3′－ACTAGTATTATTGTGCACCAATCT－TCCTG－5′（下劃線部分為酶切位點SpeⅠ），以cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增帶有酶切位點的MsWRKY56基因完整編碼區(qū)，PCR產(chǎn)物連接克隆載體pMDl9－T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a。菌體PCR檢測后將含有目的條帶的陽性克隆送北京華大基因公司測序。

1.3.5 表達(dá)載體MsWRKY56－GFP構(gòu)建 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SpeⅠ酶切帶有綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）基因的植物表達(dá)載體pA7－GFP和克隆載體pMD－MsWRKY56，目的片段連接到載體上，構(gòu)建表達(dá)載體MsWRKY56－GFP。

1.3.6 洋蔥轉(zhuǎn)化 構(gòu)建好的表達(dá)載體通過基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，以空載體pA7－GFP作為對照，通過綠色熒光蛋白基因在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況對目的基因編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsWRKY56基因cDNA序列的獲得

以大豆WRKY56基因為探針?biāo)阉鬈俎貳ST數(shù)據(jù)庫，由獲得的EST序列EST488307（GenBank登錄號：BG586539.1）、EST484458（GenBank登錄號：BG582712.1）、EST489803（GenBank登錄號：BG588028.1）、MTYCD13TF（GenBank登錄號：EV254769.1）、EST430689（GenBank登錄號：BE998966.1）、NF037H12EC1F1103（GenBank登錄號：BF645569.1）和 MEUB956TR（GenBank登錄號：GE352014.1）拼接獲得1個長1 267bp的重疊群，根據(jù)拼接的序列設(shè)計引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，獲得1條1 200bp左右的條帶（圖1），測序后比對發(fā)現(xiàn)該序列與其他物種的WRKY家族成員有很高的同源性，將此序列命名為MsWRKY56（GenBank登錄號：JN008710.1），包含1個951bp的最大開放閱讀框，編碼317個氨基酸（圖2）。

圖1 MsWRKY56基因RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 RT－PCR amplification of MsWRKY56gene

2.2 MsWRKY56基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

生物信息學(xué)分析表明MsWRKY56基因編碼蛋白等電點為8.53，相對分子量為35.4kDa，大部分區(qū)域表現(xiàn)為親水性（圖3）；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該蛋白含有大量螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)（圖4）；該蛋白不包含信號肽，定位于細(xì)胞核中。通過系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與來自大豆的 WRKY56蛋白聚為緊密一支，說明它們的親緣關(guān)系較近。

2.3 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建和重組子鑒定

利用XhoⅠ和SpeⅠ對pMD－MsWRKY56載體和亞細(xì)胞定位載體pA7－GFP進(jìn)行雙酶切，然后純化酶切產(chǎn)物、連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。單克隆經(jīng)菌落PCR檢測，可擴(kuò)增出1條1 000bp左右插入片段，與目的片段（951bp）分子量基本相符；通過雙酶切鑒定可在1 000bp左右檢測到目的條帶（圖6），重組質(zhì)粒經(jīng)測序表明，與克隆序列完全一致，開放閱讀框正確，表明亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建成功。

圖2 MsWRKY56基因序列及推測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and predicted amino acid sequence of the MsWRKY56

圖3 MsWRKY56基因編碼蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)Fig.3 The hydrophobicity analysis of MsWRKY56protein

圖4 MsWRKY56基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.4 The secondary structure of MsWRKY56protein

2.4 亞細(xì)胞定位分析

利用基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞后，使用共聚焦顯微鏡觀察洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，沒有導(dǎo)入目的基因的空載體轟擊洋蔥表皮細(xì)胞后，整個細(xì)胞內(nèi)都有綠色熒光，而轟擊表達(dá)載體MsWRKY56－GFP的洋蔥表皮細(xì)胞只在細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光（圖7），表明該基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核，與之前的生物信息學(xué)分析結(jié)果相符。

圖5 MsWRKY56與其他WRKY蛋白的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of MsWRKY56and other WRKYs

圖6 表達(dá)載體MsWRKY56－GFP酶切鑒定Fig.6 Enzyme digestion of expression vector MsWRKY56－GFP

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子在生物體生命周期每一過程中發(fā)揮重要作用，研究轉(zhuǎn)錄因子對于揭示生物體生長發(fā)育以及對外界環(huán)境響應(yīng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。WRKY家族參與調(diào)節(jié)植物的多種生物學(xué)途徑，目前對該家族的研究主要集中于基因克隆與功能鑒定等初級階段，作為一種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，其作用模型尚不清楚。Asai等［27］的研究表明 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能受絲裂原激活蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）的調(diào)節(jié)，植物體內(nèi)的MAPK、MAPK激酶（MAPKK）和 MAPKK 激酶 （MAPKKK）構(gòu)成MAP激酶級聯(lián)，通過一系列的磷酸化反應(yīng)將外界信號逐步放大并傳遞到細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)各種生理生化反應(yīng)。田云等［28］推測，各種環(huán)境誘導(dǎo)因子與細(xì)胞膜上的受體作用，通過某種機制激活體內(nèi)的MAP激酶級聯(lián)系統(tǒng)，MAP激酶級聯(lián)系統(tǒng)通過一系列的磷酸化反應(yīng)激活WRKY轉(zhuǎn)錄因子的活性，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與W－box元件發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)啟動子中含有該元件的相關(guān)功能基因或其他調(diào)節(jié)因子基因的表達(dá)，參與植物各種重要生理應(yīng)答反應(yīng)。

基于表達(dá)序列標(biāo)簽的電子克隆策略，是近年來發(fā)展起來的一門快速克隆基因的新技術(shù)，其技術(shù)核心是利用生物信息學(xué)技術(shù)組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長cDNA序列。從GenBank的核酸（nr）數(shù)據(jù)庫中檢索已測序列植物的目的基因，獲得目的基因cDNA序列，以該序列為模板對另一種未測序列植物EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，獲得與之部分同源的EST群，從中選取1條EST作為種子序列BLAST檢索該植物的EST數(shù)據(jù)庫，將檢出與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群（contig），再以此重疊群序列重復(fù)以上BLAST檢索過程，反復(fù)進(jìn)行EST重疊群序列的拼接和比對，直至檢出所有的重疊EST或重疊群不能繼續(xù)延伸，最終獲得未測序列植物基因的cDNA全序列。隨著EST數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步完善，電子克隆策略已成為克隆新基因的重要方法。與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，電子克隆成本低，速度快，針對性強，廣泛應(yīng)用于重要功能基因篩選。

植物體內(nèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與多種生理生化反應(yīng)，Dong等［29］發(fā)現(xiàn)49個擬南芥WRKY基因受丁香假單孢菌（Pseudomonassyringae）和茉莉酸甲酯（SA）誘導(dǎo)；Mare等［30］從大麥中發(fā)現(xiàn)一個新的 WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因HvWRKY38，該基因與植物的冷脅迫和干旱脅迫應(yīng)答相關(guān)；仇玉萍等［31］從低溫（4℃）誘導(dǎo)的水稻葉片cDNA文庫中克隆獲得13個WRKY基因，其中有10個WRKY基因的表達(dá)受到NaCl、PEG、低溫（4℃）和高溫（42℃）等非生物逆境因子的影響；Yoda等［32］從煙草中克隆到1個WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因受煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）誘導(dǎo)；Xie等［33］獲得48個WRKY基因全長cDNA序列，其中有4個受ABA誘導(dǎo)表達(dá)；Lagace和 Matton［34］，Robatzek和Somssich［35］，Miao等［36］，Luo等［37］的研究表明WRKY基因與植物的生長發(fā)育相關(guān)，Park等［38］發(fā)現(xiàn)擬南芥 WRKY7轉(zhuǎn)錄因子具有一個鈣調(diào)蛋白結(jié)合域（calmodulin－binding domain，CaMBD），且能與鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）結(jié)合，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在CaM介導(dǎo)的Ca2＋信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有一定的作用。本研究利用電子克隆與實驗克隆相結(jié)合的方法，獲得1個紫花苜蓿WRKY基因家族成員的cDNA序列，通過蛋白比對發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白與大豆WRKY56基因編碼蛋白高度同源。Zhou等［39］的研究表明，大豆WRKY56基因在鹽脅迫，干旱脅迫和寒冷脅迫處理后表達(dá)量沒有明顯變化，該基因可能不受非生物脅迫的誘導(dǎo)，其具體功能還有待進(jìn)一步研究。

目前已有一些方法評價蛋白在生物體內(nèi)的物理和化學(xué)狀態(tài)，但是研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的生物活性，需要在活性細(xì)胞內(nèi)檢測到這些蛋白，所以研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況具有重要意義。研究蛋白亞細(xì)胞定位的方法主要有：融合報告基因定位法、免疫組織化學(xué)定位法、蛋白質(zhì)組學(xué)定位技術(shù)以及共分離標(biāo)記酶輔助定位法，其中融合報告基因定位法主要使用的報告基因有綠色熒光蛋白（GFP）和β－葡糖酸苷酶（GUS）。通過構(gòu)建目的基因與綠色熒光蛋白的融合表達(dá)載體對編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究，容易操作，實驗周期相對較短，靈敏度高，可以適應(yīng)于活體實時定位和動態(tài)研究，此方法目前被廣泛應(yīng)用［40］。本研究構(gòu)建該基因的瞬時表達(dá)載體，通過基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞的方法發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核中，這與轉(zhuǎn)錄因子的特征相符，為進(jìn)一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子的作用模式奠定了基礎(chǔ)。

圖7 洋蔥表皮細(xì)胞GFP熒光觀察Fig.7 Fluorescence detection in the onion skins cells

4 結(jié)論

本研究采用電子克隆和實驗克隆結(jié)合的方法獲得1個紫花苜蓿WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的cDNA序列，該序列長1 267bp，包含1個951bp的最大開放閱讀框，編碼317個氨基酸；生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該基因編碼蛋白等電點為8.53，相對分子量為35.4kDa，大部分區(qū)域表現(xiàn)為親水性，包含大量螺旋和折疊結(jié)構(gòu)，不包含信號肽，定位于細(xì)胞核中；通過構(gòu)建該基因的瞬時表達(dá)載體，運用基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞的方法對該基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析，該基因編碼蛋白定位于細(xì)胞核中，與生物信息學(xué)分析相符，表明生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測的結(jié)果具有一定的可靠性。

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