草坪禾草根腐病病原菌生物學(xué)特性研究

古麗君，徐秉良＊，李彬，梁巧蘭

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室 中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070）

＊隨著我國草坪業(yè)的發(fā)展，綠地面積的擴(kuò)大及草坪集約化管理程度的提高，病害逐漸成為影響草坪質(zhì)量、降低草坪利用年限的主要限制因素之一，致使草坪提早衰敗、難以利用，甚至廢棄。草坪禾草根腐病（Pythiumdiseases）是一種破壞力極強(qiáng)的病害，草坪禾草根腐病引起根、莖和心葉腐爛，發(fā)病條件適宜時(shí)，能在一夜之間毀壞大面積草坪，對(duì)景觀效果破壞極為嚴(yán)重。它既能在冷濕生境中侵染危害，也能在天氣炎熱時(shí)猖獗流行，從坪草中分離出多種腐霉菌［1］，其中引起草坪禾草根腐病之一的瓜果腐霉（Pythiumaphanidermatum）具有很強(qiáng)的致病力和廣泛的寄主范圍。

國內(nèi)外有關(guān)草坪禾草根腐病病原的鑒定以及病害藥劑防治等方面已有報(bào)道。Abad等［2］報(bào)道大約有33種腐霉菌可以侵染多年生黑麥草（Loliumperenne）和匍匐剪股穎（Agrostisstolonifera），其中瓜果腐霉、終極腐霉（Pythiumultimum）在30～35℃時(shí)有很強(qiáng)的致病性。石潔等［3］對(duì)保定市冷季型草坪草根腐病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明，保定市草坪根腐病的主要病原菌為鐮刀菌（Fusarium）、腐霉菌（Fythium）及離孺孢菌（Bipolaris sorokiniana），其中腐霉菌的分離頻率為19.2%；張玉琴等［1］認(rèn)為腐霉菌的寄主范圍非常廣泛，所有的冷季型草坪草和暖季型草坪草狗牙根（Cynodondactylon）容易被瓜果腐霉侵染；穆合塔爾等［4］研究發(fā)現(xiàn)，草地早熟禾（Poa pretensis）、紫羊茅（Festucarubra）、高羊茅（Festucaarundinacea）和多年生黑麥草對(duì)腐霉枯萎病感性有差異，它們分別代表極感、高感、中感和低感類型，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果模擬出在草坪上防治腐霉枯萎病的農(nóng)藥及適宜用藥量。李崴等［5］研究認(rèn)為，天津地區(qū)腐霉枯萎病的致病菌主要為瓜果腐霉菌。腐霉屬種間的差異性導(dǎo)致草坪草不同器官受侵染的程度不同，所采取的防治措施也不盡相同。張金林等［6，7］從多年生黑麥草上分離得到的瓜果腐霉毒素對(duì)多年生黑麥草具有很強(qiáng)的破壞作用。楊亞君等［8］就瓜果腐霉毒素對(duì)多年生黑麥草的抗病性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)多年生黑麥草對(duì)毒素敏感。徐嬌等［9］通過對(duì)光合系統(tǒng)Ⅱ、丙二醛、超氧自由基、希爾反應(yīng)活力、根系活力以及葉片含水量等指標(biāo)的測定，明確了瓜果腐霉毒素對(duì)多年生黑麥草的致病機(jī)理。古麗君等［10］研究發(fā)現(xiàn)，深綠木霉（Trichodermaaureoviride）對(duì)引起禾草腐霉病原菌瓜果腐霉有明顯的抑制作用，主要作用機(jī)制為重寄生作用。

目前，有關(guān)草坪禾草根腐病病原生物學(xué)特性方面的系統(tǒng)資料相對(duì)較少［11］。余永年和馬國忠［12］報(bào)道了溫度對(duì)中國腐霉屬菌絲生長的影響，并討論它在分類學(xué)和親緣關(guān)系上的意義。徐嬌等［13］只研究了瓜果腐霉PA1菌株在不同溫度下的生長速率。孫淑琴等［14］通過連續(xù)3年對(duì)天津地區(qū)草坪腐霉枯萎病病害發(fā)生調(diào)查，總結(jié)出病害發(fā)生規(guī)律：高溫高濕的氣候條件是腐霉枯萎病發(fā)生的主要因素，通過病原菌致病性測定，篩選強(qiáng)致病性菌株，鑒定其為瓜果腐霉，并進(jìn)行了溫度、pH值、碳氮源對(duì)菌落生長速率影響的研究。研究該病原菌的生物學(xué)特性對(duì)了解其所致病害的發(fā)生規(guī)律和制定有效的防治措施具有重要的意義。因此本試驗(yàn)對(duì)瓜果腐霉菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了深入詳細(xì)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從蘭州市發(fā)病嚴(yán)重的混播草坪禾草中采集新鮮的草坪禾草根腐病病株，進(jìn)行組織分離培養(yǎng)，經(jīng)病原菌形態(tài)、培養(yǎng)性狀和致病性等方面的研究，確定主要致病菌為腐霉屬的瓜果腐霉［15］。2009年9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)已鑒定的病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性試驗(yàn)。

1.2 生物學(xué)特性試驗(yàn)

1.2.1 溫度對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響 取培養(yǎng)4d的菌落，用無菌打孔器（d＝0.5cm）沿菌落邊緣打取菌塊移入PDA平板中央，每皿1塊，分別置于5，10，15，20，25，30，35，40，45℃條件下無光照保濕培養(yǎng)12 h，十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算菌落平均生長速度［16］。每個(gè)處理5次重復(fù)。20d后挑取老熟菌絲涂片，并于10×鏡下隨機(jī)記數(shù)一個(gè)視野內(nèi)的孢子囊、卵孢子產(chǎn)量，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)記數(shù)5個(gè)視野。

1.2.2 光照對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響 將已接種的PDA培養(yǎng)皿分為5組，作如下處理：1）25℃持續(xù)光照培養(yǎng)24h（光照培養(yǎng)箱）；2）25℃持續(xù)黑暗培養(yǎng)24h；3）25℃黑暗12h與光照12h交替培養(yǎng)24h；4）紫外線照射2h后于25℃連續(xù)黑暗培養(yǎng)24h；5）紫外線照射2h后于25℃持續(xù)光照培養(yǎng)24h，測量菌落直徑，計(jì)算菌落平均生長速度。20d后測孢子囊、卵孢子產(chǎn)量。每處理重復(fù)5次。

1.2.3 pH值對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響 用0.1mo1／L的NaOH或HCl將滅過菌的PDA培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH 為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0七個(gè)梯度，將菌塊接在不同pH 的PDA平板中央，25℃下培養(yǎng)24 h，測量菌落直徑，計(jì)算菌落平均生長速度。20d后測孢子囊、卵孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.4 碳源對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響 試驗(yàn)所用的基本培養(yǎng)基每升蒸餾水中含1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、30g蔗糖、0.5g KCl、2g NaNO3，制平板時(shí)每升培養(yǎng)液中加入17 g瓊脂。分別以相同質(zhì)量的葡萄糖、麥芽糖、淀粉、D－木糖和山梨醇代替基本培養(yǎng)基中的蔗糖，配成不同碳源的培養(yǎng)基，并以不加碳素的培養(yǎng)基為對(duì)照。沿菌落邊緣取直徑為0.5cm菌塊接入平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后觀察菌體形態(tài)情況，并測量菌落直徑。20d后測孢子囊、卵孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.5 氮源對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響 分別以相同質(zhì)量的硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、脲替代上述基本培養(yǎng)基中的NaNO3，配成不同氮源的培養(yǎng)基，并以不加氮素、補(bǔ)加2g 0.1mol／L NaCl的培養(yǎng)基為對(duì)照。將菌塊接在不同氮源的平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測量菌落直徑，計(jì)算菌落平均生長速度。20d后測孢子囊、卵孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.2.6 不同的培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響 供試培養(yǎng)基為PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養(yǎng)基）、CMA（玉米粉瓊膠培養(yǎng)基）、CAA（胡蘿卜瓊膠培養(yǎng)基）、OA（燕麥片瓊膠培養(yǎng)基）、TCA（番茄瓊膠培養(yǎng)基）。接菌后置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后測量菌落直徑。20d后測孢子囊、卵孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理重復(fù)5次。

PDA［17］：馬鈴薯200g，葡萄糖10～20g，瓊膠17～20g，水1 000mL，將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水1 000mL煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯，加水補(bǔ)足1 000mL。然后加糖和瓊膠，加熱使瓊膠完全溶化后，分裝滅菌（121℃，20min）。

CMA［18］：玉米粉300g，瓊膠17g，水1 000mL，玉米粉加水1 000mL，在沸水浴上加熱1h，紗布過濾后加水補(bǔ)足1 000mL，加瓊膠溶化后分裝滅菌（121℃，20min）。

CAA［19］：新鮮胡蘿卜200g，瓊膠20g，水1 000mL，將新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500mL，用組織搗碎機(jī)搗碎約40s，雙層紗布過濾去渣，加水補(bǔ)足1 000mL，加入瓊膠溶化后分裝滅菌（121℃，20min）。

OA［19］：燕麥片30g，瓊膠17～20g，水1 000mL，配制的方法與玉米粉瓊膠培養(yǎng)基相同。

TCA［19］：番茄汁300g，瓊膠20g，CaCO30.4g，水80mL，番茄果實(shí)用水洗凈切片，榨汁2min，雙層紗布過濾，濾液即為所制備的番茄汁，加入瓊膠溶化后分裝滅菌（121℃，20min）。20d后測產(chǎn)孢量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響

瓜果腐霉菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬，菌絲在15～40℃內(nèi)均可生長，不同溫度條件下，菌落擴(kuò)展速度不同，最適宜溫度為30～35℃，低于10℃或高于45℃時(shí)菌落停止生長（圖1）。溫度在15～40℃均可產(chǎn)生孢子囊，但是在30～35℃時(shí)孢子囊產(chǎn)量相對(duì)較低，即在菌落生長最適溫度下孢子囊的產(chǎn)量最低，在菌落生長不利的溫度下孢子囊的產(chǎn)量較高；卵孢子在20～25℃時(shí)的產(chǎn)量最大，低于10℃或高于30℃時(shí)不產(chǎn)生卵孢子，卵孢子的產(chǎn)生條件較為嚴(yán)格。

圖1 溫度對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of temperature on the hyphae growth，sporangium and oospore quantity

2.2 光照對(duì)病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響

處理2、處理5為全黑暗條件培養(yǎng)，菌落生長速度分別為6.46和6.58cm／d（圖2），黑暗條件有利于菌落的擴(kuò)展，紫外光處理2h后的菌落生長速度最快，說明紫外光照射可以促進(jìn)菌絲的生長，全光照條件下培養(yǎng)的菌落生長速度最慢；光照對(duì)孢子囊、卵孢子的產(chǎn)量影響很大，紫外燈處理2h后全光照條件培養(yǎng)的孢子囊產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他培養(yǎng)條件，紫外光處理可以大大提高孢子囊的產(chǎn)量；黑暗條件有利于卵孢子的產(chǎn)生，全黑暗條件下卵孢子的產(chǎn)量達(dá)到12個(gè)／10倍視野，紫外光照射會(huì)抑制卵孢子的產(chǎn)生。

圖2 光照對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of light on the hyphae growth，sporangium and oospore quantity

2.3 pH值對(duì)病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響

瓜果腐霉菌對(duì)酸堿度適應(yīng)范圍很廣，在pH值4～10內(nèi)均可生長，最適于菌落擴(kuò)展的pH值為7～8，其長勢繁茂，日生長量可達(dá)到4.30～4.45cm。堿性條件有利于孢子囊的產(chǎn)生，pH為9時(shí)孢子囊產(chǎn)量達(dá)到峰值；酸性條件有利于卵孢子的產(chǎn)生，pH為6時(shí)卵孢子的產(chǎn)量顯著高于其他pH值時(shí)，堿性條件卵孢子產(chǎn)量較低，當(dāng)pH為10時(shí)，不產(chǎn)生卵孢子（圖3）。

2.4 碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響

瓜果腐霉能利用多種碳源和氮源，在多種碳源中以蔗糖生長速度最快，山梨醇次之，D－木糖生長最差。方差分析結(jié)果顯示，瓜果腐霉菌在蔗糖培養(yǎng)基、山梨醇培養(yǎng)基上的生長速度均顯著高于其他培養(yǎng)基，以蔗糖培養(yǎng)基為最好。以淀粉為碳源則菌絲厚度、孢子囊及卵孢子的產(chǎn)量都最大，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SSPS方差分析表明，以淀粉、蔗糖、葡萄糖為碳源時(shí)，瓜果腐霉菌孢子囊產(chǎn)量極顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.01），以淀粉為碳源時(shí)，瓜果腐霉菌卵孢子產(chǎn)量極顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.01）。

瓜果腐霉菌絲對(duì)供試的氮源均可利用，方差分析結(jié)果顯示，供試菌株在以NH4NO3作為氮源的培養(yǎng)基上生長速度和孢子囊產(chǎn)量均顯著高于其他培養(yǎng)基（P＜0.05），同時(shí)菌落厚度也最大，無氮源情況下菌絲厚度很小。以脲為氮源則有利于促進(jìn)卵孢子的產(chǎn)生（表1）。

圖3 pH對(duì)菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on the hyphae growth，sporangium and oospore quantity

2.5 不同的培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響

瓜果腐霉在CAA培養(yǎng)基上生長速度最快，與其他培養(yǎng)基差異極顯著（P＜0.01）；但是在PDA培養(yǎng)基和TCA培養(yǎng)基上菌落厚度最大；在CMA培養(yǎng)基上孢子囊產(chǎn)量最大，與其他培養(yǎng)基差異極顯著（P＜0.01）；在OA培養(yǎng)基上卵孢子產(chǎn)量最大（表1）。

表1 不同碳、氮源及培養(yǎng)基種類對(duì)瓜果腐霉菌絲生長及孢子囊、卵孢子產(chǎn)量的影響（25℃）Table 1 Effect of different carbon，nitrogen and various medium on hyphae growth，sporangium and oospore quantity

3 結(jié)論與討論

張金林等［20］報(bào)道我國坪草病害的種類約30多種，其中由瓜果腐霉菌引起的腐霉枯萎病在北方發(fā)生普遍，對(duì)多種草坪草造成嚴(yán)重的危害。草坪腐霉枯萎病是一種毀滅性病害，病害的發(fā)生與多種因素有關(guān)［21］。而目前有關(guān)瓜果腐霉菌生物學(xué)特性方面的系統(tǒng)資料相對(duì)較少，因此，進(jìn)行病原菌的生物學(xué)特性試驗(yàn)有重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)病原菌生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，瓜果腐霉菌在15～40℃均能生長，菌絲生長適宜溫度為30～35℃，這與徐嬌等［13］報(bào)道的瓜果腐霉PA1菌株生長的最適溫度相似。這些都與該病在每年6－9月高溫季節(jié)迅速發(fā)生流行［22］相一致。因此，在高溫氣候來臨之前，一定要作好病害的預(yù)防工作。15～20℃時(shí)病原菌可以產(chǎn)生的孢子囊最多，同時(shí)在40℃時(shí)也可以產(chǎn)生較多的孢子囊；20～25℃卵孢子的產(chǎn)量最大。因此，瓜果腐霉通過孢子囊越夏、卵孢子越冬。

通過光照試驗(yàn)可以得出，黑暗條件有利于病害的蔓延，光照條件病害發(fā)生較慢，這也就印證了瓜果腐霉菌在適宜的溫濕度條件下能夠在一夜之間破壞大面積草坪的觀點(diǎn)。卵孢子的產(chǎn)生會(huì)受到光照的抑制，但是光照可以大大提高孢子囊產(chǎn)量。瓜果腐霉菌菌絲生長適宜pH值為8，堿性條件（pH＝9）有利于孢子囊的產(chǎn)生，酸性條件（pH＝6）有利于卵孢子的產(chǎn)生，因此，偏堿性土壤上的草坪發(fā)病重于酸性土壤，改善土壤酸堿度可以有效預(yù)防病害的發(fā)生。許多種糖類均可成為該病菌利用的碳源，其中對(duì)病原菌菌絲生長有明顯促進(jìn)作用的碳源是蔗糖，對(duì)病原菌菌絲厚度、孢子囊及卵孢子產(chǎn)量有顯著促進(jìn)作用的碳源是淀粉；在氮源方面，NH4NO3對(duì)菌絲生長、孢子囊及卵孢子產(chǎn)量都有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)菌絲生長旺盛。這與真菌數(shù)量和氮素正相關(guān)［23］理論上相一致。施用過多氮肥既會(huì)造成草坪草徒長，又會(huì)加劇根腐病的發(fā)生，因此，少施氮肥對(duì)控制該病害的發(fā)生有顯著作用。

草坪禾草根腐病病害的發(fā)生除了與溫度、光照、pH等主要因素相關(guān)外，還與水肥管理、修剪、種植草坪品種等因素密切相關(guān)。在生產(chǎn)上應(yīng)采取綜合的管理和防治措施，病害發(fā)生前后，積極做好預(yù)防和防治工作等，將病害發(fā)生程度降低到最低水平。具體措施是：合理修剪，使草坪通風(fēng)透光，搞好草地衛(wèi)生以減少初侵染源。比較有效的草坪衛(wèi)生措施是在秋末和冬季或初春對(duì)草坪進(jìn)行焚燒，這樣可以減少下一生長季節(jié)的初侵染源。此外，修剪時(shí)割下的草葉要及時(shí)清理出草坪，攜帶有病蟲害的要及時(shí)焚燒或掩埋。培養(yǎng)健壯草坪，均衡適量的增施磷、鉀肥可以提高抗病性。在草坪建植中應(yīng)選用不同的抗病種或品種混播，以降低草坪病害的發(fā)生。根腐病危害嚴(yán)重的草坪，要及時(shí)進(jìn)行化學(xué)防治。

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