極低頻率電磁場對肝癌細胞SODD和Survivin基因表達的影響

張 琰， 劉雅恬， 趙炎斌， 寇瑩瑩， 劉宇飛， 吳劍秋

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)為原發(fā)性肝癌，是我國最常見的惡性腫瘤之一，目前臨床上仍然沒有有效的治療方法。極低頻率電磁場(extremely low frequency electromagnetic field, ELF)是一種新興的腫瘤治療方法[1]。已經有報道顯示，ELF對于許多惡性腫瘤都有一定的治療效果，但是ELF治療惡性腫瘤的機制，特別是分子機制不甚明了[2-4]。本研究試圖通過分析ELF對肝癌細胞系BEL-7402與正常肝細胞系L-02中的SODD和Survivin 基因表達的影響，揭示ELF對肝癌細胞凋亡相關基因表達的影響，從而探尋ELF治療肝癌的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌細胞系BEL-7402以及正常肝細胞L-02購自中國科學院上海細胞庫。RNeasy Mini Kit試劑盒購自QIAGEN公司；SODD、Survivin、β-actin引物購自南京金思特科技有限公司；RT試劑盒、PCR試劑盒購自Tiangen公司；鼠抗人SODD和Survivin 抗體購自Sigma公司。低頻率電磁場由武漢市海軍工程學院提供(型號：DL-D03)。額定電壓：220 V，單相頻率：100 Hz，由可調變壓器及電阻調節(jié)輸出磁場強度。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 將肝癌細胞系BEL-7402以及正常肝細胞L-02置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，飽和濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，當細胞生長活力良好時使用。

1.2.2 ELF對肝癌細胞的處理 將肝癌細胞系BEL-7402與正常肝細胞L-02接種到孔板中，并分別置于磁場強度為0.7 mT的磁場中進行干預，每天刺激2次，每次1 h，作用3天。

1.2.3 總RNA提取、純化與RT-PCR檢測 按說明書用TRIzol提取肝癌細胞系BEL-7402與正常肝細胞L-02中的總RNA，通過紫外分光光度計檢測RNA的產量并檢測RNA的純度。以此RNA為模板，70℃滅活10 min，加入10 mmol/L oligo(dT)18、dNTP、AMV逆轉錄酶及5xAMV逆轉錄酶緩沖液等，合成cDNA。隨后加入SODD、Survivin、β-actin引物，分別行PCR擴增。SODD上游引物序列：5′- CACAGAACCCTGGAATGACCC-3′，下游引物序列：5′- AACCAGACCCTCATGGCTAC-3′；Survivin上游引物序列：5′- AACCAGACCCTCATGGCTAC-3′，下游引物序列：5′-TTCCCAGACTCCACTCCAAC-3′；β-actin上游引物序列：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物序列：5′- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR擴增條件：95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共31個循環(huán)。以6 μL擴增產物進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，β-actin檢測逆轉錄效率，以凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析。

1.2.4 FCM檢測SODD和Survivin蛋白的表達 收集ELF作用后的細胞，70%冷乙醇固定2 h，PBS洗滌2次，鼠抗人SODD和Survivin單克隆抗體室溫固定30 min，PBS洗滌2次，加入二抗為FITC標記的羊抗鼠或羊抗兔IgG避光染色30 min。同時設陰性對照用PBS代替一抗和二抗，同型對照組只加入二抗。流式細胞儀測定熒光強度，以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的表達情況，F(xiàn)I=(樣本蛋白熒光強度-同型對照的熒光強度)/正常對照的熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測SODD和Survivin基因表達結果

由RT-PCR的結果顯示，在ELF處理前后，L-02肝細胞中SODD的表達與β-actin條帶的灰度比值分別為1.203±0.046和1.105±0.037(P>0.05)；L-02肝細胞中Survivin的表達與β-actin條帶的灰度比值分別為0.402±0.039和0.389±0.041(P>0.05)，見圖1。在ELF處理前后，BEL-7402肝癌細胞中SODD的表達與β-actin條帶的灰度比值分別為1.606±0.058和0.793±0.051(P<0.05)；BEL-7402肝癌細胞中Survivin的表達與β-actin條帶的灰度比值分別為0.523±0.045和0.253±0.044(P<0.05)，見圖2。

圖1 SODD與Survivin在正常肝細胞L-02中的表達

圖2 SODD與Survivin在BEL-7402細胞中的表達

2.2 FCM檢測SODD和Survivin蛋白表達的結果

FCM測定結果顯示，經ELF處理后，L-02細胞SODD和Survivin蛋白表達與處理前相比無明顯差異(P>0.05)，而BEL-7402細胞SODD和Survivin蛋白表達明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 ELF對肝癌細胞及正常細胞SODD和Survivin蛋白表達的影響

3 討論

流行病學調查顯示，肝細胞癌的發(fā)生率在全世界一直高居前列，而且近年來其發(fā)生率還在持續(xù)上升中[5]。長期以來，肝細胞癌的療效并不穩(wěn)定，廣大的研究者也正積極探索新療法。近年來的研究表明，磁場對荷瘤動物的免疫力和離體腫瘤細胞的生物性狀都會產生影響，使用磁場類型和強度不同，所產生的生物學效應也不盡相同[6-7]。其中，極低頻率電磁場(頻率為0～300 Hz的交變電磁場)對惡性腫瘤的治療正逐漸被人們關注[8]。但目前有關ELF與肝癌凋亡抑制基因的報道很少，故本研究以肝癌細胞系BEL-7402為研究對象，分析ELF處理前后凋亡抑制基因SODD和Survivin表達的變化，以期從分子水平揭示ELF對肝細胞癌治療的作用機制。

SODD是Jiang等[9]利用酵母雙雜交系統(tǒng)在尋找與DR3死亡結構域結合的蛋白時發(fā)現(xiàn)的，屬BAG蛋白家族成員。SODD能特異識別并結合于TNFRⅠ、Bcl-2、DR3及HSP /HSC70胞漿段死亡結構域(death domains, DD)。對其生物學功能，目前僅知道在TNFRⅠ信號途徑中SODD為關鍵負調節(jié)蛋白，通過其DD域與TNFRⅠ結合，當三聚體TNF與TNFRⅠ結合后，可改變受體的分子構型，使SODD與TNFRⅠ胞漿段很快分離，暴露出TNFRⅠ的DD，后者進一步結合TRADD等接頭分子，形成TNFRⅠ信號復合物，啟動誘導細胞凋亡的信號傳導。高表達的SODD可抑制TNFRⅠ介導的細胞凋亡，若抑制細胞內SODD的表達，則無需激活TNF/TNFRⅠ途徑，即可誘導凋亡的發(fā)生[10]。理論上若腫瘤細胞中SODD過度表達，則會充分與TNFRⅠ胞漿段死亡結構域結合，阻斷凋亡信號蛋白的聯(lián)系，導致腫瘤細胞對死亡受體介導的凋亡敏感性下降，進而表現(xiàn)出化療耐藥[11]。但文獻中有關腫瘤細胞SODD的表達及意義的報道少見，更未見其用于肝癌治療的研究，而本研究證實其在肝癌細胞中表達上調，且經ELF處理后表達顯著下降，說明ELF可能通過此途徑抑制肝癌生長、轉移。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitors of apoptosis protein, IAP)中的一員，在控制細胞分裂以及抑制凋亡中均起著重要作用。Survivin選擇性表達于結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤，通過直接或間接抑制caspases抑制凋亡，從而促進了腫瘤細胞存活與生長。有研究表明，利用siRNA使Survivin基因表達下調能夠增加腫瘤細胞凋亡率，降低腫瘤細胞增殖能力，增加腫瘤細胞對各種化療藥物和放療的敏感性[12]。還有研究指出在HCC細胞株中轉染Survivin后G0/G1期的細胞顯著減少，而S期的細胞顯著增多，且在肝癌組織中Survivin表達與增殖指數(shù)呈顯著正相關，并發(fā)現(xiàn)Survivin是通過與CDK4相互作用，使CDK4釋放P21而促進細胞增殖的[13]。這都表明Survivin的過表達不僅減少了細胞的凋亡，也促進了癌細胞的增殖活性，如阻止其表達可以促進腫瘤細胞的凋亡。本研究結果表明Survivin在肝癌細胞中的表達高于正常細胞，經ELF處理后，其表達也出現(xiàn)下調。

本研究中，ELF能夠促進抑制凋亡基因SODD、Survivin在肝癌細胞中的表達下調，提示ELF在促進肝癌細胞凋亡方面具有重要作用，為ELF在臨床治療肝癌提供了新的線索和治療靶點。

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