非小細(xì)胞肺癌組織與癌旁組織SEMA3B基因甲基化分析

李金田， 李 明， 陳森清， 張?jiān)f， 馬國建

已有研究發(fā)現(xiàn)，近80%的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)存在染色體3p21.3區(qū)域的等位基因缺失，與NSCLC形成密切相關(guān)[1-2]。SEMA3B基因是位于該區(qū)域上的一個抑癌基因，從肺癌細(xì)胞系研究表明，肺癌細(xì)胞中SEMA3B基因的啟動子高甲基化與該基因的表達(dá)缺失十分一致，SEMA3B異常高甲基化比正常非甲基化樣本的NSCLC風(fēng)險(xiǎn)增加了12.8倍[3]。提示啟動子甲基化可能是SEMA3B基因失活的主要原因之一，但臨床實(shí)驗(yàn)研究資料相對不足。本研究對NSCLC患者癌組織和癌旁組織的SEMA3B基因啟動子區(qū)域進(jìn)行甲基化PCR檢測，旨在分析該基因啟動子區(qū)域CpG島DNA甲基化與非小細(xì)胞肺癌演進(jìn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)手術(shù)獲取NSCLC癌組織及癌旁組織標(biāo)本23例，其中左側(cè)肺癌14例，右側(cè)肺癌9例。男18例，女5例。病理分型：腺癌11例、鱗癌12例?；颊吣挲g39～75歲，平均年齡58歲，年齡中位數(shù)57歲。手術(shù)切除的組織標(biāo)本登記后于-80 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本的采集均經(jīng)患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 SEMA3B基因的DNA甲基化檢測

1.2.1 組織基因組DNA提取 癌組織及相對應(yīng)的癌旁組織由-80℃冰箱中取出，自然解凍后取1 mm×1 mm×1 mm組織塊，經(jīng)DNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)提取基因組DNA。

1.2.2 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 從患者癌組織和癌旁組織中提取的基因組DNA被試劑盒修飾(CpGenomeTMDNA Modification Kit, Chemicon，USA)，修飾方法參照說明書。

1.2.3 甲基化特異PCR(MSP) SEMA3B基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化模式由MSP檢測。針對甲基化與非甲基化序列設(shè)計(jì)了兩對特異性引物(M和U)，非甲基化引物為5′-GTGGTTAGGTGGGGTATTTTT-3′與5′-ATCAACAATAAAAACAAAAACA-3′，甲基化引物為5′-TGGTTAGGCGGGGTATTTTC-3′ 與5′-TCAACAATAAAAACGAAAACG-3′；產(chǎn)物長度分別為135 bp和133 bp。MSP的實(shí)驗(yàn)步驟與常規(guī)PCR完全相同，反應(yīng)體系25 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL(含Mg2+), 0.2 mmol/L dNTP，Hot Start Taq酶 1U/25 μL, 引物濃度0.4 pmol/μL, 經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的DNA 2 μL。兩對引物的退火溫度均為60 ℃。以經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的已知甲基化DNA標(biāo)本(CpGenomeTMUniversal Methylated Control DNA)和已知非甲基化標(biāo)本(CpGenomeTMUniversal Unmethylated Control DNA)分別作為甲基化陽性對照和陰性對照，雙蒸水作為空白對照。2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

1.3 克隆測序驗(yàn)證

針對MSP有疑問的結(jié)果，重新對經(jīng)過化學(xué)修飾的DNA模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，將擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆后隨機(jī)挑取陽性克隆進(jìn)行DNA測序分析(華大基因，中國北京)判斷甲基化位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行甲基化率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

用兩對引物分別對亞硫酸氫鈉處理過的23例NSCLC癌組織與癌旁組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并經(jīng)過對疑問MSP結(jié)果標(biāo)本經(jīng)過DNA克隆測序驗(yàn)證，癌組織標(biāo)本中SEMA3B基因啟動子區(qū)有19例發(fā)生異常甲基化，異常甲基化發(fā)生率為82.6%(19/23)；相對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中SEMA3B基因啟動子區(qū)有18例發(fā)生異常甲基化，異常甲基化發(fā)生率為78.3%(18/23)。NSCLC癌組織與癌旁組織都表現(xiàn)出SEMA3B基因啟動子區(qū)異常甲基化，兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。甲基化特異PCR產(chǎn)物電泳圖和克隆驗(yàn)證測序圖見圖1。

表1 SEMA3B基因甲基化檢測結(jié)果

圖1 甲基化特異PCR產(chǎn)物電泳圖和克隆驗(yàn)證測序圖

圖解：SEMA3B基因MSP產(chǎn)物凝膠電泳圖和甲基化特異引物擴(kuò)增陽性產(chǎn)物克隆測序圖(下劃線為引物區(qū)及非引物區(qū)的CpG位點(diǎn))。Marker：DNA marker； P+：甲基化陽性對照； P-：未甲基化陰性對照；M：甲基化條帶；U：未甲基化條帶；T18：癌組織；N18、N27：癌旁組織； C：水空白對照。

對SEMA3B基因甲基化狀態(tài)與患者臨床表現(xiàn)及病理等進(jìn)行多因素對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肺癌組織及癌旁組織標(biāo)本中，SEMA3B基因甲基化異常與患者發(fā)病年齡、性別、病理類型及分化等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。

3 討論

肺癌的發(fā)生有一個相當(dāng)長的臨床前期，在細(xì)胞遺傳信息調(diào)控上，累積著原癌基因的突變﹑激活，抑癌基因的雜合缺失﹑突變或啟動子區(qū)域DNA甲基化導(dǎo)致的失活等變化。在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因由于啟動子CpG島甲基化造成基因功能關(guān)閉，不僅抑制基因的表達(dá)，還改變蛋白和DNA的相互作用，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，是導(dǎo)致抑制基因失活的重要原因之一[4]。SEMA3B基因在多種癌癥及腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出的啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化表明，SEMA3B基因啟動子5’CpG島的高甲基化在某些情況下可能是該抑癌基因失活的唯一機(jī)制。由于抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是癌癥發(fā)生的一個重要機(jī)制[5]，因此在癌癥早期了解相關(guān)抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，對于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療癌癥顯得十分重要[2、6]。

本研究對比分析了NSCLC患者癌組織和癌旁組織SEMA3B基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在NSCLC癌組織和癌旁組織中均出現(xiàn)SEMA3B基因啟動子的高甲基化。排除實(shí)驗(yàn)中的主觀誤差及用克隆測序證實(shí)，癌組織標(biāo)本中SEMA3B基因啟動子區(qū)異常甲基化發(fā)生率為82.6%，相對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本中為78.3%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明癌旁組織中發(fā)生的SEMA3B基因啟動子CpG島異常甲基化事件和癌組織中的甲基化同時(shí)存在，并且癌旁組織中SEMA3B基因甲基化異常的發(fā)生可能要早于細(xì)胞的惡性增生，提示啟動子甲基化的改變是腫瘤發(fā)生過程中的一個早期事件，但這與患者發(fā)病年齡、性別、病理類型等無關(guān)。NSCLC原發(fā)灶細(xì)胞有近端向遠(yuǎn)端周圍正常組織漸進(jìn)浸潤轉(zhuǎn)移癌變的趨勢，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，癌旁組織中的發(fā)生SEMA3B基因啟動子CpG島異常甲基化可能是由于腫瘤的早期轉(zhuǎn)移所致。這將對肺癌的治療及術(shù)后微轉(zhuǎn)移提供積極的輔助監(jiān)測指標(biāo)。由于病例數(shù)較少，還需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證研究。

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