SFRP1基因甲基化及其蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達

方漢林， 于在誠， 祝會斌

Wnt信號通路是調(diào)控細胞生長、運動和分化的關(guān)鍵途徑。Wnt途徑異常激活與胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生有關(guān)，在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled related protein-1, SFRP1)是該通路的拮抗基因之一，其表達下調(diào)可減弱對通路的拮抗作用從而引起通路的異常激活，促進腫瘤發(fā)生[1]。相關(guān)研究表明，基因啟動子區(qū)5′端CpG島甲基化是引起基因表達下調(diào)的重要機制[2]。本實驗應(yīng)用免疫組化SP法及甲基化特異性PCR法研究SFRP1基因甲基化在NSCLC中表達，以尋找SFRP1基因與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展及分化、轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為NSCLC的早期診斷、治療提供理論依據(jù)。

1 資料及方法

1.1 研究資料 研究對象均來自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科的非小細胞肺癌患者，共60例。其中男性32例，女性28例，中位年齡53歲。全部患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。所有病例均行肺癌根治術(shù)加淋巴結(jié)清掃術(shù)，均由組織病理學(xué)診斷證實。另取手術(shù)治療的21例肺良性疾病病例作為對照，其中男性13例，女性8例。每位患者標本離體30 min內(nèi)取材，一部分放置于-80℃低溫冰箱保存提取DNA，另一部分進行石蠟包埋，常規(guī)HE染色備用。標本組織學(xué)類型(按WHO標準分類)：腺癌47例，鱗癌13例；按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997標準進行臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期20例；腫瘤細胞分化程度：低分化26例，中高分化34例；病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。

1.2 免疫組化 標本石蠟切片脫蠟和水化，枸櫞酸鈉緩沖液煮沸，孵育10 min，加第一抗體4℃孵育過夜，加生物素標記的第二抗體，再次孵育10 min后，加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，用PBS沖洗，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。每批染色均設(shè)置陽性和陰性對照，用已知陽性組織切片作為陽性對照，PBS替代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：SFRP1蛋白陽性表達定位于胞質(zhì)，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞，每張切片隨機選取10個高倍鏡(×40)視野，腫瘤陽性細胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.3 甲基化特異性PCR 提取標本中基因組DNA, 亞硫酸氫鈉修飾。按照試劑說明書, 應(yīng)用Wizard DNA Clean-up System純化DNA。以修飾后的DNA作為模板進行PCR擴增, 反應(yīng)體系：DNA 2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，引物各0.5 μL，dNTP 2 μL，Taq酶0.2 μL，雙蒸水17.3 μL。引物序列和反應(yīng)條件見表1。2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，Biospectrum AC凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

表1 SFRP1基因甲基化和非甲基化引物序列及PCR條件

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計檢驗，統(tǒng)計學(xué)方法為χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFRP1基因甲基化情況 60例NSCLC組織中35例SFRP1基因甲基化陽性，甲基化率為58.3%；21例正常肺組織中3例SFRP1基因甲基化陽性，甲基化率為14.3%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.118,P=0.001)。SFRP1蛋白在NSCLC的陽性表達率為50.0%(30/60)，低于肺良性疾病的85.7%(18/21)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.218,P=0.004)。SFRP1基因甲基化及蛋白表達與肺癌臨床及病理因素的關(guān)系是：SFRP1基因甲基化與NSCLC細胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有明顯的相關(guān)性；SFRP1蛋白表達與NSCLC臨床分期、細胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有明顯的相關(guān)性(見表2)。

2.2 SFRP1基因甲基化與其蛋白表達的相關(guān)性分析 在60例NSCLS組織標本中，SFRP1甲基化表達陽性的35例中有24例(68.6%)SFRP1蛋白表達缺失；25例SFRP1甲基化表達陰性的NSCLC中有7例(28.0%)SFRP1蛋白表達缺失。SFRP1甲基化和SFRP1蛋白表達缺失存在相關(guān)性(χ2=9.613,P=0.002)。

3 討論

分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)是一種分泌型糖蛋白家族，其定位于染色體8p 12～11.1[3]，由SFRP基因編碼，SFRP約有300個氨基酸殘基，包括一個同源的N-末端CRD和一個C末端[4]。SFRP家族被認為是Wnt信號通路的胞外拮抗物，含有5種分泌型糖蛋白家族成員，SFRP1是家族成員之一，研究證實其高度表達于肺細胞。

表2 SFRP1基因甲基化表達與腫瘤臨床及病理因素的關(guān)系

Wnt信號通路的異?；罨谀[瘤發(fā)生中具有重要作用[5]。作為Wnt信號通路抑制因子，SFRP1的甲基化可以導(dǎo)致基因沉默，而對Wnt信號通路的抑制作用減弱，從而促進腫瘤的形成與發(fā)展。重新恢復(fù)SFRP1表達，可拮抗Wnt信號通路，抑制腫瘤的形成和發(fā)展并促進細胞凋亡的發(fā)生。這為腫瘤的治療提供了新的思路。

本研究中，我們用甲基化特異性PCR法和免疫組化SP法分別檢測60例非小細胞肺癌和21例良性肺標本的SFRP1基因甲基化及蛋白表達情況，結(jié)果表明：在60例非小細胞肺癌組織標本中，SFRP1基因甲基化率為58.3%，而正常肺組織標本則為14.3%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.118,P=0.001)，SFRP1基因甲基化與患者的臨床分期、性別、吸煙與否、病理類型無明顯相關(guān)，而與患者的細胞分化程度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，從而可以推測啟動子區(qū)域甲基化導(dǎo)致的基因功能失活可能發(fā)生在肺癌形成的早期。SFRP1蛋白表達陽性率在非小細胞肺癌組織標本為50.0%，而在正常肺標本中為85.7%，SFRP1蛋白缺失與患者的性別、吸煙與否、病理類型無明顯相關(guān)，而與患者的臨床分期、細胞分化程度以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Suzuki等[6]發(fā)現(xiàn)SFRP1基因第一個外顯子周圍有著高密度的CpG島，SFRP1基因甲基化主要就表現(xiàn)在第一外顯子的高甲基化，與其失轉(zhuǎn)錄明顯相關(guān)。SFRP1基因甲基化后可能通過激活Wnt途徑，直接導(dǎo)致該途徑中的核心效應(yīng)蛋白β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)的累積并轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達[7]，從而參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。另外，我們通過對SFRP1基因甲基化與蛋白表達的相關(guān)性分析，可以看出SFRP1甲基化和SFRP1蛋白表達缺失存在密切關(guān)系(χ2=9.613,P=0.002)。SFRP1甲基化主要發(fā)生在啟動子區(qū)域的CPG位點，SFRP1基因由于啟動子甲基化而失活，抑制基因的表達，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，最終導(dǎo)致SFRP1基因蛋白表達減低，而其產(chǎn)物的減少減弱對細胞異常增殖的抑制調(diào)控，促進肺癌的發(fā)生。因此，我們通過本實驗可以認為SFRP1基因蛋白表達降低有可能是由于SFRP1基因甲基化改變導(dǎo)致的。由于我們在本實驗中采用了免疫組化SP法和甲基化特異性PCR法的精確度和靈敏度不同，也有可能機體存在能糾正基因的異常甲基化的機制，導(dǎo)致了11例SFRP1甲基化的NSCLC SFRP1蛋白表達升高。當(dāng)然這也不能排除是由于基因錯配、缺失、重排等導(dǎo)致的SFRP1蛋白表達異常，但所占總比例較低。

總之，SFRP1基因甲基化和SFRP1蛋白表達降低在NSCLC中是非常普遍的現(xiàn)象，SFRP1基因甲基化很可能是導(dǎo)致SFRP1蛋白表達降低的重要機制，從而導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生發(fā)展，因此檢測這個指標對預(yù)測NSCLC的生長和轉(zhuǎn)移潛能具有一定的指導(dǎo)意義。

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