HMGB1在腎透明細胞癌中的表達及其臨床意義

張明星, 竇中嶺, 史海軍, 劉 輝, 王曉彬

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC) 是泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，占泌尿系腫瘤的第二位，其患病率呈逐漸增高趨勢。腎透明細胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)是腎細胞癌中最常見的一種病理類型，占RCC的60%～80%，大多數(shù)發(fā)生于中老年人，死亡的主要原因是腫瘤的浸潤和轉移，且患者易在沒有任何臨床癥狀的情況下出現(xiàn)廣泛轉移，故嚴重威脅著我國中老年人的健康。因此探討RCCC的浸潤轉移機制尤為重要，發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性均理想的腫瘤標記物對此有著極為重要的意義。本研究通過檢測高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在RCCC中的表達情況及其與臨床病理參數(shù)的相關性，闡述其在RCCC發(fā)生發(fā)展和浸潤轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南科技大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科2009年至2011年間經(jīng)病理證實為RCCC的手術患者70例，其中男性46例，女性24例，年齡35～87歲，平均年齡60歲。常規(guī)術后甲醛固定石蠟包埋，全部標本HE染色后均經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師診斷。按2002年美國抗癌協(xié)會(AJCC)腎細胞癌TNM分期標準：Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期21例，Ⅳ期9例；組織學分級：高分化32例，中分化21例，低分化17例；有淋巴結轉移15例，無淋巴結轉移55例。同時，選取癌旁(距癌組織邊緣3 cm)的正常腎組織40例；另收集同期在我院因外傷或腎結石行開放手術的20例正常腎組織。所有患者術前均未接受放療、化療和免疫治療，全部標本HE染色后均經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師診斷。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 所有標本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，采用免疫組化二步法檢測。一抗?jié)饪s型兔抗人HMGB1多抗(稀釋度為1∶100)和二抗生物素標記的兔抗小鼠IgG(工作濃度為1∶2 000)均購自武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。每例標本切5張，每次染色時均用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.2 結果判定 HMGB1表達位于細胞核，表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用雙盲半定量法評估其染色，無陽性細胞為(-)，陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞數(shù)不超過25%為(+)，25%～50%為(++)，50%以上為(+++)。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件處理，多組有序分類變量采用Kruskal-Wallis檢驗，各組之間兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗，按不同臨床病理指標進行分組，各組間的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化

表1可見，HMGB1在正常腎組織、癌旁組織、RCCC中的陽性表達率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。依次為25.0%、37.5%、82.8%，RCCC組的表達較正常腎組織組、癌旁組織組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而正常腎組織組與癌旁組織組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1，圖1～3。

表1 HMGB1在正常腎組織、癌旁組織及RCCC組織中的表達

2.2 RCCC患者HMGB1表達與臨床病理指標的關系

在70例RCCC中，HMGB1蛋白陽性表達率在臨床分期Ⅲ期和Ⅳ期高于Ⅰ期和Ⅱ期，有淋巴結轉移組高于無淋巴結轉移組，腫瘤直徑≥5 cm組高于腫瘤直徑<5 cm組，腫瘤有壞死組高于無壞死組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而與年齡、性別、分化程度、腫瘤所在部位均無關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 RCCC患者HMGB1表達與臨床病理指標的關系

3 討論

高遷移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)是根據(jù)其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中有很高的遷移率而得名，是與染色體結合的非組蛋白成分之一。HMGB1基因定位于染色體13q12，HMGB1蛋白含215個氨基酸殘基，該蛋白在翻譯后進行糖基化、?；?、甲基化、磷酸化等修飾加工活動。根據(jù)結構特點，HMG超家族可分為HMGB、HMGN、HMGA三類。真核細胞染色質中含有豐富的HMGB1，且在進化過程中高度保守，其氨基酸序列同源性在大鼠和小鼠間達100%，在人和嚙齒動物間高達99%。HMGB1分子包含2個“L”型HMG box結構域，HMG Box A和HMG Box B均包含80～90個氨基酸殘基，中間有相似的重復氨基酸序列，呈較強的堿性，為DNA非特異性結合區(qū)，其酸性的C-末端包含超過30個連續(xù)的天冬氨酸和谷氨酸殘基，借以完成和其他蛋白質之間交互作用及調節(jié)HBGB1與DNA結合[1]。HMGB1主要分布于細胞核內，參與多種基本的生物學過程如DNA復制、轉錄、重組及細胞的分化、成熟等。他與DNA結合，可穩(wěn)定核小體形狀，作為基因和組織特異性的轉錄調控因子有調節(jié)轉錄活性的作用[2]。盡管HMGB1蛋白結構缺乏縮氨酸先導肽，且不能穿出內質網(wǎng)和高爾基細胞器，但仍可釋放到細胞漿，甚至細胞外。HMGB1具有多重“身份”[3]：一種抗凋亡蛋白；當他從細胞核內被動釋放，則是一種創(chuàng)傷細胞死亡信號；活躍分泌的HMGB1是一種細胞因子，作為應激信號和炎癥因子誘導細胞因子，激活炎癥細胞；HMGB1在細胞外的其他信號角色，諸如可溶性分化因子等。研究表明，多種腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白表達，HMGB1與癌細胞的發(fā)生發(fā)展侵襲和轉移密切相關[4]。Xin等[5]經(jīng)免疫組化及Western blot分析顯示，HMGB1在宮頸鱗癌組織中，尤其是發(fā)生轉移的宮頸鱗癌組織中呈強陽性表達。Sharma等[6]通過分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1的表達水平與腫瘤的發(fā)生階段相關，腫瘤發(fā)生早期HMGB1表達率為20%，而晚期表達率為80%。Wu等[7]利用免疫組化分析鼻咽癌臨床病理標本，HMGB1高表達率為53.6%，且HMGB1過表達與腫瘤臨床T級、N級及遠處轉移顯著相關。

針對HMGB1在腫瘤細胞中的過度表達，目前至少有兩種解釋：HMGB1的過度表達可以導致與腫瘤表型基因的反常表達，從而引起腫瘤；或者，在已經(jīng)獲得腫瘤表型基因的細胞中，只有那些存在HMGB1過度表達的細胞才能幸免于細胞凋亡，繼續(xù)生長，引起腫瘤。另外一種可能是，過度表達HMGB1的細胞或者由于壞死(如因為缺氧)而被動釋放，或者主動分泌，均可將HMGB1釋放入細胞外介質中。細胞外HMGB1繼而促進鄰近腫瘤細胞或腫瘤支持血管增殖[8]。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，HMGB1蛋白在腎透明細胞癌中的表達率為82.8%，在癌旁組織中的表達率為37.5%，在正常腎組織中表達率為25.0%，說明HMGB1表達可能與腎組織良惡性行為有關。腫瘤直徑≥5 cm組較<5 cm組HMGB1陽性率明顯增加，腫瘤有壞死組較腫瘤無壞死組HMGB1陽性率明顯增加，說明HMGB1的表達可能抑制細胞凋亡，加速了腫瘤的生長，同時HMGB1促進腫瘤抗原的呈遞和樹突狀細胞(DC)的成熟，從而激發(fā)保護性的抗腫瘤免疫反應，使腫瘤細胞壞死?？梢酝茰yHMGB1的表達在RCCC的發(fā)生發(fā)展中起著雙重作用[9]。此外，RCCC中HMGB1高表達在有淋巴結轉移組、高分期組中比例明顯高于無淋巴結轉移組和低分期組，提示HMGB1可能以某種機制參與RCCC的浸潤、轉移過程，這些表現(xiàn)與其在結、直腸腫瘤中的表現(xiàn)相似[10]。同時我們的研究發(fā)現(xiàn)，雖然HMGB1在低分化癌組織中的表達強于高、中分化癌組織，但差異無統(tǒng)計學意義，說明其與腫瘤的分化程度可能無明顯關系。此外，HMGB1表達與年齡、性別、腫瘤部位無關。近來有研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在腫瘤的侵襲期間起著關鍵作用，該蛋白涉及腫瘤轉移的形成及腫瘤的生長[11]。腫瘤侵襲期間HMGB1通過與其配體晚期糖基化終產(chǎn)物受體結合，激活p38、SPA/JNK和p42/p44MAPK等信號通路，繼而引起基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9激活，后兩者是纖維蛋白溶酶激活級聯(lián)的下游目標，能使細胞外基質降解促進腫瘤浸潤、轉移。通過阻斷HMGBl信號傳導通路能顯著抑制腫瘤的生長、浸潤及轉移，并能抑制免疫缺陷鼠自發(fā)形成腫瘤。

作為HMGB1配體的RAGE的過表達也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關，尤其是浸潤性胃癌[12]。對于前列腺癌和結直腸癌患者來說，HMGB1和RAGE的聯(lián)合表達預示腫瘤的轉移傾向和較差的預后[13-14]。日本學者研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1的配體RAGE在具高遷移能力的胰腺癌細胞株MIA PaCa-2和PANC- l中高表達，而在低遷移能力BxPC-3中幾乎沒有表達[15]。迄今為止，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的腫瘤細胞中都有HMGB1的表達上調，且其配體RAGE在不同的腫瘤細胞中也高表達，給予HMGB1或RAGE抑制劑，可明顯抑制某些腫瘤細胞的增殖[16]。在腎透明細胞癌中可能也存在著這種機制，提示應用HMGB1選擇性抑制劑是防治腎癌的可行性途徑之一，可為臨床治療腎癌提供新的思路和方法。

總之，由于HMGB1被認為是一種普遍存在的染色質蛋白質，而且目前已證明在大多數(shù)腫瘤中過度表達，并與腫瘤的發(fā)生、浸潤及轉移密切相關，因此HMG1具有極大的潛力作為腫瘤預后標志物，或者腫瘤基因治療的靶基因。本研究結果提示在RCCC中可以檢測這個指標，將其作為臨床工作中判斷RCCC惡性程度和預后估計上的有效分子指標；HMGB1高表達提示患者預后不良，這對RCCC治療方案的選擇和預后評估有重要意義，但是還需要進一步的研究證實。

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