液相色譜柱基質(zhì)材料的發(fā)展

摘 要:色譜柱是色譜分離的核心，色譜基質(zhì)填料是色譜界研究的熱點。與氣相色譜相比較，液相色譜可分析檢測的有機(jī)物范圍廣泛，可以滿足80%有機(jī)物的檢測，為了方便迅速地選擇適合的色譜柱，綜合了解液相色譜分離基質(zhì)材料(填料及整體柱)的分類及表征手段是十分必要的。

關(guān)鍵詞:液相色譜 基質(zhì)材料 發(fā)展

中圖分類號:O652.6\t\t文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A\t\t\t文章編號:1672-3791(2011)10(a)-0052-02

高效液相色譜的基質(zhì)材料包括填料和整體柱材料，填料可分為無機(jī)基質(zhì)填料和有機(jī)基質(zhì)填料，無機(jī)基質(zhì)填料包括硅膠、氧化鋁、氧化鋯、羥基磷灰石、氮化物以及活性碳等。此外還有復(fù)合物材料，即通過精細(xì)調(diào)控技術(shù)制備的無機(jī)-有機(jī)球雜交基球，經(jīng)化學(xué)衍生后，制備得對藥物分析和篩選很有用的高效、可耐pH2～8、低吸附性的新型填料。

在吸附色譜中，硅膠、氧化鋁、活性炭和聚酰胺應(yīng)用最為廣泛。其中活性炭柱色譜尤其適用于分離水溶性物質(zhì)，如氨基酸、糖類以及某些苷類，它是分離水溶性物質(zhì)的主要吸附材料之一。聚酰胺也稱為錦綸或尼龍，其吸附機(jī)理主要來自聚酰胺內(nèi)的酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵，例如，聚酰胺樹脂可以吸附保健品中具有羥基、羧基或酚羥基的黃酮類化合物。

在離子交換色譜中，離子交換樹脂主要是利用高分子化學(xué)的加聚反應(yīng)。一般首先合成高分子離子交換樹脂的骨架，然后在骨架上添加功能基。如果需要得到大孔樹脂，則在聚合過程中加入致孔劑，如果不添加致孔劑，則得到凝膠型樹脂。在高分子離子交換樹脂中，骨架多數(shù)采用交聯(lián)度為1%～20%范圍的聚苯乙烯，它由二乙烯苯交聯(lián)制得，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，通過磺化反應(yīng)可制備強(qiáng)酸性陽離子樹脂;通過氯甲基化后，再與各種胺反應(yīng)，可得到各種陰離子樹脂。少數(shù)離子交換樹脂的骨架可由交聯(lián)聚丙烯酸類樹脂構(gòu)成。

在親和色譜中，固定相由載體、鍵合臂和具有特殊選擇性的親和基團(tuán)組成，該親和基團(tuán)稱為配基。常見的載體有瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺和硅膠等。配基有兩大類，第一類是具有專一親和力，如抗原與其對應(yīng)的抗體。另一類是沒有專一親和力的假親和色譜，這類配基典型的代表是染料配基和硼酸鹽配基。其中，免疫球蛋白IGG的檢測過程中使用的蛋白柱即是一種親和色譜柱，免疫球蛋白IGG與蛋白柱之間的親和作用及洗脫過程是通過流動相中的pH值、離子強(qiáng)度及化學(xué)組成來控制的，該類親和色譜柱易滋生霉菌，因此柱子的存儲十分重要，比如蛋白柱就需要保存在20%的乙醇的水溶液中，并冷藏于4℃環(huán)境。

縱觀幾大分離色譜，大多數(shù)具有特異分離效果的色譜材料均是復(fù)合型色譜填料，以下重點介紹的是制備型及分析型液相色譜柱色譜填料的種類、整體柱及色譜基質(zhì)的表征手段。

1 基質(zhì)填料種類

1.1 硅膠

無機(jī)基質(zhì)材料中最重要的是硅膠，微粒型硅膠的出現(xiàn)，促進(jìn)了高效液相色譜法的發(fā)生與發(fā)展。用作色譜填料基質(zhì)的硅膠是通過人工合成的，其制備方法多樣，大都擁有各自的專利。合成色譜用硅膠區(qū)別于天然晶體二氧化硅，也區(qū)別于介于晶型和無定型之間的用于色譜、電色譜中的石英毛細(xì)管，用作色譜填料的是無定型二氧化硅。硅膠吸附色譜是色譜中的經(jīng)典，硅膠至今仍是制備色譜中填充柱的主要材料，250目～400目(即40μm～63μm直徑)的硅膠顆粒的含水量直接影響活性，其活性隨著含水量的升高而降低。當(dāng)其含水量接近20%的時候，硅膠基本不具吸附活性;活性太高，則出現(xiàn)不可逆吸附和拖尾，甚至分離物分子結(jié)構(gòu)的改變。以下將重點介紹其化學(xué)修飾及聚合物包覆的過程。

硅膠能用于色譜基質(zhì)材料，是因為其表面具有重要的活性基團(tuán)硅羥基，即自由硅羥基，或稱孤立硅羥基。由于游離的硅羥基是造成色譜峰尤其是堿性溶質(zhì)拖尾的主要原因，因此在合成反相色譜材料中，針對硅羥基的封尾技術(shù)非常重要。例如C18柱，在鍵合了十八烷基后，還需通過小分子的硅烷化試劑(例如三甲基氯硅烷)對其進(jìn)行封尾，以盡可能地減小極性大的硅羥基對整體呈現(xiàn)非極性的色譜柱的影響，如若硅羥基外露，封尾不完全，勢必影響反相色譜的保留時間和色譜峰型。

對硅膠表面進(jìn)行的改性是通過該活性基團(tuán)進(jìn)行的，通過各種硅烷化試劑對硅膠表面進(jìn)行修飾，可以得到包括烷烴和芳烴在內(nèi)的烷基反相填料。常用的硅烷化試劑除了氯硅烷和烷氧基硅烷外，還有烷基硅氨烷。例如:在硅羥基上鍵合十八烷基，可制得液相色譜柱中常用的C18柱(ODS);以氨基、羧基、磺酸基修飾，可得到離子交換填料;以聚乙二醇修飾，可得到疏水作用的填料。對于化學(xué)鍵合相硅膠，在孔徑、粒徑相當(dāng)?shù)那疤嵯?，穩(wěn)定性是其最重要的指標(biāo)，穩(wěn)定性主要指柱流失。柱流失的程度取決于鍵合反應(yīng)時的條件是否控制得當(dāng)，即是否由于水的存在，而生成易溶于有機(jī)相中的副產(chǎn)物;值得指出的是，在硅膠的預(yù)處理過程對最終硅膠基質(zhì)填料的穩(wěn)定性也有十分重要的影響，在預(yù)處理過程中，需要無機(jī)酸浸泡，以除去硅膠表面存在的會造成峰型拖尾，甚至不可逆吸附強(qiáng)極性雜質(zhì)的Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等金屬離子。

1.2 氧化鋁

用作吸附材料和色譜填料基質(zhì)的氧化鋁主要是γ-氧化鋁，γ-氧化鋁表面化學(xué)修飾比硅膠更困難，因此氧化鋁多使用于一些小分子有機(jī)化合物的分離，用于正相、離子交換色譜和反向高效液相色譜中，在生化分離上應(yīng)用得少。氧化鋁的化學(xué)修飾可通過鋁羥基的反應(yīng)或是涂覆技術(shù)。通過鋁羥基反應(yīng)可通過在氧化鋁表面上的活性羥基鍵合C4、C8和C18等烷基，制得在寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，應(yīng)用于反相色譜中的烷基化氧化鋁。表面涂覆可以制得聚苯乙烯-二乙烯基、聚丁乙烯或十八烷基硅烷等強(qiáng)疏水性復(fù)合材料。

在吸附型制備色譜中，氧化鋁的吸附能力比硅膠更強(qiáng)，氧化鋁比硅膠的樣品處理量更大，根據(jù)含水量大小(0%～15%)，大多情況下，需要控制的含水量為6%～10%，對應(yīng)的活性為第三和第四等級。根據(jù)酸堿性，應(yīng)用于吸附色譜中的氧化鋁分為中性、酸性和堿性氧化鋁，中性氧化鋁水提取液的pH值為7.5，適用于醛、酮、醌、某些苷及酸堿溶液中不穩(wěn)定化合物，如酯、內(nèi)酯等化合物的分離，因此應(yīng)用十分廣泛。大多數(shù)情況下使用的是堿性氧化鋁水提取液的pH值為9～10，常應(yīng)用于碳?xì)浠衔锏姆蛛x，能中碳?xì)浠衔镏谐ズ趸衔铮€能對某些色素，甾族化合物、生物堿、醇以及其他中性、堿性物質(zhì)的分離。酸性氧化鋁水提取液的pH值為4～4.5，適用于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分離。

1.3 氧化鋯

氧化鋯和硅膠一樣，具有優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度，適宜的孔結(jié)構(gòu)和可用于鍵合其他功能基團(tuán)的活性位點外，還具有更寬的pH耐受范圍和更好的耐溫性。氧化鋯多孔小球可耐受pH0～14的環(huán)境，可高達(dá)900℃的溫度下長時間工作不會變形且結(jié)構(gòu)不遭受破壞。碳十八鍵合二氧化鋯（ODZ）可在pH2～12范圍內(nèi)使用。聚丁二烯包覆二氧化鋯復(fù)合填料在全pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定，并且能耐200℃的柱溫。王暉等制備強(qiáng)離子（HO3S-PS-ZrO2）和強(qiáng)陰離子新型固定相[(Me)3N+-PS-ZrO2]，并嘗試性地用于糖、核苷、核苷酸和脫氧核苷酸的分離。

1.4 復(fù)合型填料

復(fù)合型填料在上文中已有提及，一般而言，硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合相在pH2～8的范圍內(nèi)穩(wěn)定，難以耐受更寬的pH范圍，在堿性條件下硅膠基質(zhì)會發(fā)生溶解，于是人們將機(jī)械強(qiáng)度較低、在有機(jī)溶劑中易發(fā)生溶脹的高聚物引入到硅膠基質(zhì)填料中，與硅膠形成優(yōu)勢互補(bǔ)，制備出有機(jī)-無機(jī)復(fù)合型填料，即包覆型填料或涂覆型填料。

硅膠、氧化鋁、氧化鋯等都曾被用作包覆型填料的基質(zhì)材料，其中最重要的是硅膠和氧化鋯。用于包覆無機(jī)基質(zhì)填料的高聚物則有聚苯乙烯、聚乙基苯乙烯-二乙烯基苯、聚丁二烯、聚環(huán)氧乙烷、聚硅氧烷、瓊脂糖、聚氯甲基苯乙烯-二乙氧基甲基乙烯基硅烷以及氣相沉積碳等。

早期包覆型填料的制備采用物理包覆法，制得的復(fù)合物孔徑結(jié)構(gòu)不甚可控，重現(xiàn)性差。后期采用的是化學(xué)鍵合或復(fù)合型包覆法。該法首先利用無機(jī)基質(zhì)表面修飾技術(shù)，使硅膠、氧化鋁或氧化鋯等基質(zhì)的表面帶上適合數(shù)量的活性基團(tuán)，例如可發(fā)生加合反應(yīng)的雙鍵、環(huán)氧基團(tuán)、氨基或羧基等，再將制備高聚物所需的單體、交聯(lián)劑等涂覆到基質(zhì)表面，然后通過加入引發(fā)劑，控溫等條件引發(fā)化學(xué)鍵合或共聚反應(yīng)，制得包覆層緊密牢固的復(fù)合色譜填料。但是由于聚合物包覆不完全，裸露出來的無機(jī)基質(zhì)會吸附路易斯堿性物質(zhì)，特別會吸附蛋白質(zhì)而導(dǎo)致峰型變差，這種吸附可以通過有機(jī)物熱蒸汽化學(xué)氣相沉積法使熱解碳對裸露無機(jī)基質(zhì)進(jìn)行包覆。

在鍵合固定相中特別值得提及的是用于手性拆分藥物、酸類、酰胺類化合物的手性分離固定相。手性固定相所使用的高分子基球通常是粒徑單分散的縮水甘油甲基丙烯酸-亞乙基二異丁烯酸酯共聚物微球、一鍋法制備的單分散聚甲基丙烯酰胺球、聚硅氧烷、光學(xué)活性聚氨基甲酸乙酯以及聚苯乙烯。通過共價鍵或涂覆方式，發(fā)展了Pirkle型(刷型)、多糖類、環(huán)糊精類、冠醚類、杯芳烴等多種類型的手性固定相。Pirkle型手性固定相的起源是被稱為CSA的手性溶解試劑;多糖類手性固定相主要包括纖維素類和直鏈淀粉類;環(huán)糊精(CDs)是含有以α-1，4-連接的β-吡喃葡萄糖單元的環(huán)狀非還原寡糖。目前，常見的環(huán)糊精有三種:6個葡萄糖單元的α-CD，7個葡萄糖單元的β-CD和8個葡萄糖單元的γ-CD。β-CD的空間結(jié)構(gòu)似籠狀，可以包結(jié)許多水溶性及非水溶性化合物，例如苯酚。同時因為β-CD的大小適中，而且具有21個羥基活性位點，可鍵合烷基、羥烷基、氨基、巰基、糖基、麥芽糖基、甲基、羥乙基、羥丙基、乙?；刃揎椈鶊F(tuán)，靈活多變，可塑性強(qiáng)，是搭建手性分離的橋梁。

1.5 整體柱

整體柱區(qū)別于微粒型填料填裝，是由單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑在柱子內(nèi)通過可控制的原位聚合反應(yīng)形成連續(xù)、整體型的柱床。整體色譜柱合并填料合成、篩選與裝柱過程，得到均勻的色譜床層結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性更好。具有利于傳質(zhì)的小孔(孔徑小于2nm)和中孔(孔徑2nm～50nm)，在較大流速下仍然具有較低的柱壓，傳質(zhì)速度快，適合快速分析和梯度模式。

整體柱主要分為有機(jī)整體柱和無機(jī)整體柱，有機(jī)整體柱主要包括聚丙烯酰胺類整體柱、聚甲基丙烯酸酯類整體柱、聚苯乙烯類整體柱和分子印記整體柱。近幾年來，整體柱備受科研機(jī)構(gòu)關(guān)注的原因是因為整體柱在合成過程中本身就可以通過選擇單體、交聯(lián)劑的種類來合成高密度的活性位點，例如:在GMA-EDMA整體柱上，可引入環(huán)氧基團(tuán)、雙鍵等活性基團(tuán)，通過對環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行修飾，可以鍵合環(huán)糊精等具有手性分離功能手性分離配基。

目前整體柱已經(jīng)在反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜、親和色譜、體積排阻色譜中獲得了應(yīng)用，可用于分離脫氧核糖核酸、肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、低聚核苷酸、類固醇、芳烴、酚類等物質(zhì)，具有廣泛的應(yīng)用前景。馬志玲等以甲基丙烯酸縮水甘油酯為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，環(huán)己醇和正十二醇混合溶液為致孔劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，制備了毛細(xì)管整體柱基質(zhì)，使用Epoxy方法在基質(zhì)表面鍵合牛血清白蛋白(BSA)，制得BSA修飾的毛細(xì)管整體柱，將此毛細(xì)管整體柱應(yīng)用于毛細(xì)管電色譜中，成功地分離出了組氨酸對映體。但該類蛋白質(zhì)手性分離色譜柱存在保存困難，使用壽命短的缺點。

可能因為整體柱的制備及鍵合反應(yīng)過程尚未能精確受控，凈化過程耗時長，及使用過程中可能出現(xiàn)脫模，及應(yīng)用上與同類型商品化柱子相比較的優(yōu)勢，距離規(guī)模商品化還有待深入探索。

2 基質(zhì)填料的性能表征

對于應(yīng)用于色譜柱中的基質(zhì)填料，必須通過一系列的表征手段來考察其性能。對于液相色譜而言，色譜柱最重要的參數(shù)主要有粒徑及粒徑分布、孔徑及孔徑分布、比表面積以及比孔容、表面形貌、柱效、滲透性及柱壓耐受性等物理及表面性質(zhì)。而化學(xué)性質(zhì)則主要包括基質(zhì)填料功能基團(tuán)的結(jié)構(gòu)解析及鍵合量。

2.1 物理及表面性質(zhì)的表征

填料的表面形貌、粒徑形狀大小及粒徑分布主要通過高倍數(shù)的掃描電鏡進(jìn)行觀測，掃描電鏡圖是優(yōu)化填料合成條件強(qiáng)大的直觀評價依據(jù);孔徑分布和比表面積一般可通過氮吸附法測定，了解基質(zhì)材料在微孔、中孔及大孔范圍內(nèi)的孔徑分布。

2.2 化學(xué)性質(zhì)的表征

對于大多數(shù)液相色譜填料的功能基團(tuán)，在中紅外、遠(yuǎn)紅外及近紅外的指紋區(qū)都有相應(yīng)的特征吸收，因此，可通過紅外光譜對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。傅里葉紅外光譜在合成填料過程中，通過比較鍵合前后基質(zhì)的紅外光譜，判別鍵合試驗是否成功。

以反相色譜柱為例，填料通常通過其含碳量來表征表面化學(xué)修飾的程度。高效液相色譜柱填料的含碳量在百分之幾到百分之二十幾之間，現(xiàn)代元素分析儀可測定化學(xué)鍵合硅膠中碳、氫和氧的含量，其測定極限約為0.2%～0.3%，完全可滿足測定需要。對于表面由單分子層修飾的基球，可通過含碳量及填料的比表面積計算修飾基的密度，進(jìn)而對不同填料進(jìn)行比較。近年來，固體核磁共振波譜技術(shù)也應(yīng)用于高效液相色譜固定相中，例如在無機(jī)基質(zhì)表面鍵合C18制備反相色譜柱中，用13C標(biāo)記C18修飾基團(tuán)，從固定相的NMR譜中的δ16～40判別十八烷基是否鍵合到無機(jī)基質(zhì)表面。而δ115屬于sp2雜化不飽和碳的核磁共振信號，可判別13C標(biāo)記苯環(huán)修飾基團(tuán)是否交聯(lián)到無機(jī)基質(zhì)表面。

3 結(jié)語

色譜作為一種分離技術(shù)與方法，發(fā)展歷經(jīng)百年，特別是液相色譜，無論是從用途(制備型或分析型)、分離原理、基質(zhì)材料，或是從發(fā)展史、分析應(yīng)用、維護(hù)上細(xì)述，都是一門豐富的學(xué)問。了解色譜材料的分類和分離原理，才可以理解色譜過程中一脈相承之處，例如固相萃取柱、固相微萃取探頭涂層和液相色譜柱。在食品問題、環(huán)境問題備受關(guān)注的今天，只有從事該行業(yè)的科研人員充分掌握了色譜的核心，才能使食品監(jiān)管、環(huán)境監(jiān)控及科研中的工作進(jìn)行得更加迅速順利。